曹靜靜，鄭顯,，劉瑤，殷志琦，蔣翠花，張健*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210028；3.中國藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室&天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

根據(jù)世界糖尿病大會(IDF)報(bào)道[1]，2019年全球約有4.63億成人患有糖尿病，預(yù)計(jì)到2045年全球糖尿病患者人數(shù)將上升至7億，其中中國糖尿病患者人數(shù)和發(fā)病率位居世界第一。糖尿病患者中超過90%為2型糖尿病(T2DM)。研究表明，胰高血糖素主要通過刺激肝臟糖異生以在空腹或饑餓時(shí)維持血糖水平[2-3]，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者肝糖異生功能異常增強(qiáng)，致使空腹血糖升高[4]。因此，挖掘特異性靶向肝糖異生的先導(dǎo)化合物，可為T2DM治療藥物的開發(fā)提供有益的參考。

青錢柳(Cyclocaryapaliurus),又名搖錢樹、麻柳等，為胡桃科青錢柳屬植物，具有降血糖、降血脂和抗氧化等功效[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)青錢柳三萜酸部位可以有效降低糖尿病小鼠的高血糖[7-8]，但其對肝臟葡萄糖代謝和糖異生的影響尚不明確。因此，本文評價(jià)青錢柳中5種主要三萜酸成分對小鼠原代肝細(xì)胞糖異生及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6Pase)的影響，以期發(fā)現(xiàn)抑制肝糖異生的先導(dǎo)化合物，為青錢柳降糖提供更充分的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物

D-Hanks緩沖液、DMEM高糖、噻唑蘭(MTT)、PBS溶液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；氯化鈣、ITS(Insulin、Transferrin、Selenium)細(xì)胞培養(yǎng)添加物、丙酮酸鈉、乳酸鈉、Ⅳ型膠原酶、地塞米松(美國Sigma公司)；無糖DMEM培養(yǎng)基、Williams′Medium E培養(yǎng)基、L-glutamin、HEPES、Ⅰ型膠原(美國Gibco公司)；EGTA、Percoll、0.4%臺盼藍(lán)染液、Triton X-100(索萊寶公司)；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、雙抗(青霉素-鏈霉素溶液)、二甲基亞砜(DMSO)、PBS(10×)、DEPC水、山羊抗兔IgG、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；glucagon(Med Chem Express公司)；二甲雙胍(愛必信生物科技有限公司)；Trizol Reagent(Ambion公司)；葡萄糖含量測試盒、BCA測試盒(南京建成生物工程研究所)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(東洋紡公司)；引物設(shè)計(jì)合成(上海捷瑞生物工程有限公司)；PEPCK、G6Pase、CK-18抗體(Abclonal公司)；內(nèi)參抗體β-tublin(沈陽萬類生物有限公司)。

arjunolic acid(1)、hederagenin(2)、3β,23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid(3)、cyclocaric acid B(4)、2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic(5)由中國藥科大學(xué)中藥制藥系殷志琦教授課題組提供，純度>98%(HPLC面積歸一化法測定)。

1.2 儀器

MS205DU精密天平(美國Mettler Tolerdo)；Vert.A1倒置熒光顯微鏡(德國CARL ZEISS公司)；Synergy H1多功能微孔板檢測儀(美國BioTek公司)；Quantsdutio DX熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；S1000PCR熱循環(huán)儀、164-5051電泳儀、電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；TUS-200P振蕩型恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)；Sapphire RGBNIR雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)(美國Azure Biosystems公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證號SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心，12 h光照循環(huán)，溫度為(24±2)℃，相對濕度(60±10)%，自由進(jìn)食和飲水條件進(jìn)行飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 小鼠原代肝細(xì)胞分離

參照Salem等[9]建立的實(shí)驗(yàn)方法，采用兩步灌注法分離小鼠原代肝細(xì)胞。小鼠采用戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉后，消毒，留置針插入下腔靜脈，在體灌注37 ℃預(yù)熱的Buffer 1灌注液(50 mL Hanks+10 mg EGTA，pH 值7.4)，戳破門靜脈，讓血水流出。Buffer 1沖完前，換Buffer 2灌注液(50 mL Hanks+11 mg CaCl2+15 mg Ⅳ型膠原酶)，灌注完成，分離肝臟置DMEM高糖中，70 μm篩網(wǎng)過濾，4 ℃、50×g離心2 min，棄上清，梯度離心液(5 mL 10×PBS+45 mL percoll+50 mL DMEM高糖)重懸，1 500 rpm離心8 min，棄上清，DMEM高糖重懸后，再次50×g離心2 min，棄上清，加入肝細(xì)胞培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，以1.5×105個(gè)/mL接種于24孔板，4 h細(xì)胞貼壁，觀察生長狀態(tài)。

2.2 小鼠原代肝細(xì)胞鑒定

2.2.1 CK-18蛋白水平檢測

分離獲得原代肝細(xì)胞以1.5×105個(gè)/mL接種于預(yù)先包被Ⅰ型鼠尾膠原的60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后，棄上清，PBS清洗細(xì)胞2次，每皿加入150 μL RIPA裂解液(含1% PMSF)，冰上裂解5 min，刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管，13 000 rpm 4 ℃離心20 min，收集上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。配制10%分離膠及5%濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，加入CK-18抗體孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌3次，加入二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光檢測法顯色。

2.2.2 免疫熒光染色

原代肝細(xì)胞按方法“2.1”項(xiàng)下鋪于24孔板培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，預(yù)熱PBS清洗2次，每次5 min，清洗完成后，吸去PBS，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min。棄去多聚甲醛，PBS清洗3次，每次5 min，每孔加入500 μL 0.5%的Triton X-100通透液，室溫靜置通透5 min。棄去通透液，PBS清洗3次，每次5 min，每孔加入500 μL 5%的BSA封閉液，室溫靜置封閉1 h。吸去封閉液，PBS清洗3次，每次5 min，吸去PBS，每孔加入300 μL稀釋后的CK-18抗體(稀釋比例為1∶200)，室溫靜置封閉2 h或4 ℃封閉過夜。吸去一抗，PBS清洗3次，每次5 min，吸去PBS，避光加入300 μL稀釋后的Alexa Fluor 488熒光二抗，室溫避光孵育1 h。吸去二抗，PBS清洗3次，每次5 min，棄去PBS，避光加入200 μL DAPI，室溫避光孵育10 min。棄去DAPI染色液，PBS清洗4次，每次5 min，棄去PBS，倒置熒光顯微鏡下拍照。

2.3 藥物配制及原代肝細(xì)胞糖異生實(shí)驗(yàn)

2.3.1 藥物配制

取一定量的青錢柳三萜酸化合物1～5，用DMSO溶解(DMSO濃度不超過最終使用濃度的千分之一)，然后用無糖DMEM稀釋至需要濃度。

2.3.2 glucagon對原代肝細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

原代肝細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下鋪于96孔板中，貼壁24 h后，將培養(yǎng)基換為含有50、100、200、400、600、800、1 000 nmol/L glucagon的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，振蕩10 min，于490 nm處測定吸光度(A)。

2.3.3 glucagon對原代肝細(xì)胞糖異生的影響

原代肝細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下鋪于24孔板中，貼壁4 h后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，用無糖DMEM潤洗后，將培養(yǎng)基換為含2 mmol/L pyruvate、20 mmol/L乳酸的無糖DMEM，并分別添加50、100、200、400 nmol/L glucagon培養(yǎng)3、6、12 h后，取上清，4 ℃、10 000 rpm離心3 min，葡萄糖測試盒測定上清中葡萄糖含量，同時(shí)用BCA試劑盒檢測各孔中蛋白濃度以校正葡萄糖含量。

2.4 5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

原代肝細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下方法鋪于96孔板中，貼壁24 h后，給藥組加入不同濃度的化合物(1、5、10、20、40、80、100 μmol/L)培養(yǎng)12 h后，方法同“2.3.2”，檢測490 nm處吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.5 5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞糖異生的影響

原代肝細(xì)胞按 “2.1”項(xiàng)下方法鋪于24孔板中，貼壁4 h后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，用無糖DMEM潤洗后，分為正常對照組(NC組，2 mmol/L pyruvate+20 mmol/L乳酸)、模型組(M組，2 mmol/L pyruvate+20 mmol/L乳酸+100 nmol/L glucagon)、給藥組(分別為10 μmol/L化合物1～5)和二甲雙胍組(Met組，150 μmol/L Metformin)，共孵育6 h后，方法同“2.3.3”，測定上清中葡萄糖含量。

2.6 G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)水平檢測

原代肝細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下方法鋪于6孔板中，貼壁4 h后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，無糖DMEM潤洗后，分為NC組、M組、給藥組(10 μmol/L化合物1、3、5)和Met組，孵育6 h后，棄去上清，PBS清洗細(xì)胞2次，用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀測定A260/280及其濃度，A260/280在1.8～2.0視為提取純度合適，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照PCR試劑盒進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。各引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列

2.7 Western Blot分析

原代肝細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下方法接種于60 mm培養(yǎng)皿中，按“2.6”項(xiàng)下條件誘導(dǎo)糖異生和分組處理，孵育6 h后，棄去上清，PBS清洗細(xì)胞2次，每皿加入150 μL RIPA裂解液(含1% PMSF)，在冰上裂解5 min，刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管，4 ℃ 13 000 rpm 離心20 min，收集上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品稀釋至相同濃度，配制10%分離膠及5%濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，加入一抗孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌3次，然后加入二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光檢測法顯色，Image pro plus 6.0軟件掃描蛋白條帶灰度值并進(jìn)行分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)

采用兩步灌注法及多次離心分離小鼠原代肝細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)肝細(xì)胞存活率>90%。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(見圖1A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種4 h后，細(xì)胞基本貼壁，形狀近似圓形，細(xì)胞核可見單核或雙核；接種20 h后，細(xì)胞變大且不規(guī)則，相鄰細(xì)胞互相連接。

3.2 小鼠原代肝細(xì)胞鑒定

3.2.1 CK-18蛋白水平檢測

CK-18是肝細(xì)胞常用的標(biāo)記蛋白。分離獲得細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，Western Blot顯示分離所得的細(xì)胞CK-18表達(dá)陽性，表明分離獲得細(xì)胞為肝臟細(xì)胞(見圖1B)。

注：A：肝細(xì)胞培養(yǎng)0～20 h(×200)；B：CK-18(1：HUVEC,2：AML12,3：自行分離細(xì)胞)；C：CK-18免疫熒光(×200)。圖1 小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

3.2.2 免疫熒光染色鑒定

肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行抗CK-18免疫熒光染色后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞輪廓清晰，綠色熒光在胞質(zhì)中均勻分布(見圖1C)，進(jìn)一步證實(shí)分離所得細(xì)胞為肝臟細(xì)胞。

3.3 肝細(xì)胞糖異生模型的建立

3.3.1 glucagon對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

如圖2A所示，MTT法檢測50、100、200、400、600、800、1 000 nmol/L glucagon對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，與NC組相比，1 000 nmol/L以內(nèi)的glucagon對原代肝細(xì)胞無毒性影響，因此選擇50、100、200、400 nmol/L濃度進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.3.2 glucagon對原代肝細(xì)胞糖異生的影響

glucagon濃度為100 nmol/L，培養(yǎng)6 h時(shí)，糖異生最為顯著(P<0.01)(見圖2B)。故選用100 nmol/L glucagon濃度的無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h建立糖異生模型。

3.4 5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

如圖3A所示，MTT法檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，化合物1、3、5在40 μmol/L及以上濃度對原代肝細(xì)胞有顯著毒性(P<0.01)，化合物2、4在20 μmol/L及以上濃度對原代肝細(xì)胞有顯著毒性(P<0.01)；此外，加入100 nmol/L glucagon刺激，以上結(jié)果無明顯變化(見圖3B)，故選取10 μmol/L的化合物1～5作為安全濃度開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：A：glucagon對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響(12 h)；B：不同濃度glucagon對原代肝細(xì)胞糖異生的影響；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 Glucagon誘導(dǎo)條件下對小鼠原代肝細(xì)胞糖異生的影響

注：A：5種成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響(12 h)；B：100 nmol/L glucagon +5種成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響(12 h)；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 青錢柳中5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

3.5 5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞糖異生的影響

如圖4所示，與NC組相比較，glucagon可誘導(dǎo)糖異生顯著升高54.9%(P<0.01)。而此條件下，10 μmol/L的化合物1、3、5的抑制率分別為16.2%、19.1%、14.9%(P<0.05)。該結(jié)果表明化合物1、3、5可以顯著抑制小鼠原代肝細(xì)胞糖異生。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 青錢柳中3種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞異生的影響

3.6 青錢柳中3種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞中G6Pase、PEPCK mRNA及蛋白表達(dá)的影響

3.6.1 藥物對G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)的影響

如圖5A所示，glucagon刺激可顯著增加G6Pase和PEPCK的mRNA(P<0.01)，在此條件下，10 μmol/L的化合物1、3、5可顯著降低G6Pase和PEPCK的 mRNA水平(P<0.05)，說明化合物1、3、5可顯著降低glucagon刺激條件下原代肝細(xì)胞中G6Pase和PEPCK mRNA表達(dá)。

3.6.2 化合物1、3、5對G6Pase、PEPCK蛋白水平的影響

如圖5B所示，與NC組相比，glucagon刺激條件下，G6Pase和PEPCK的蛋白水平顯著增加38.7%、55.9%(P<0.05)，化合物1、3、5干預(yù)后可顯著降低G6Pase和PEPCK的蛋白水平(P<0.05)。提示化合物1、3、5可顯著降低glucagon刺激條件下原代肝細(xì)胞中G6Pase和PEPCK蛋白的表達(dá)。

注：A：G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)水平；B：G6Pase、PEPCK蛋白水平；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖5 青錢柳中3種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞中G6Pase、PEPCK蛋白水平及mRNA表達(dá)的影響

4 討論

肝內(nèi)胰高血糖素反應(yīng)失調(diào)，肝糖異生功能明顯增強(qiáng)，是產(chǎn)生高血糖的主要原因之一，有效抑制肝糖異生是控制血糖的重要方式[3,10-11]。本實(shí)驗(yàn)建立了糖異生細(xì)胞水平篩選模型，利用小鼠原代肝細(xì)胞評價(jià)化合物對糖異生的影響，發(fā)現(xiàn)來自青錢柳三萜酸的天然產(chǎn)物arjunolic acid、3β,23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid、2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic通過調(diào)控G6Pase、PEPCK的表達(dá)水平，有效抑制肝糖異生。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病的發(fā)生多因臟腑虛損、陰虛燥熱，并主張以“清熱瀉火、養(yǎng)陰生津”來治療糖尿病。中藥黃連、秋葵、石斛、青錢柳等均可降低血糖。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連能抑制炎癥，降低大鼠血糖[12]；秋葵可改善肥胖，降低血糖[13]；石斛能改善胰島β細(xì)胞功能[14]；青錢柳可以提高糖耐量[15]。其中，青錢柳作為藥食兩用植物[16]，食用方便、味道甘甜且降糖效果顯著，越來越受到關(guān)注。已有研究證實(shí)，青錢柳降糖主要活性成分為三萜和黃酮類化合物[17]。研究表明青錢柳三萜中青錢柳酸B和青錢柳苷H可改善糖代謝紊亂，其機(jī)制包括改善胰島素抵抗、促進(jìn)葡萄糖攝取等[18]。而本實(shí)驗(yàn)研究表明青錢柳三萜酸中主要成分arjunolic acid、3β,23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid和2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oi可以通過抑制糖異生降低血糖。

本研究發(fā)現(xiàn)青錢柳三萜中主要成分arjunolic acid、3β,23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid、2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oi可以抑制胰高血糖素誘導(dǎo)條件下的糖異生，提示上述單體可能是通過調(diào)控胰高血糖素信號通路發(fā)揮作用的。作為調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶，AMPK可通過影響胰高血糖素信號通路調(diào)控肝臟糖異生[19]。研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳三萜類化合物可通過調(diào)控AMPK促進(jìn)葡萄糖攝取，進(jìn)而達(dá)到降糖效果[8,18]。可見，上述3種單體抑制糖異生的機(jī)制可能與AMPK有關(guān)。

綜上所述，本研究在前期青錢柳降糖作用研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)青錢柳中部分三萜酸類成分可顯著抑制糖異生，進(jìn)一步完善了青錢柳三萜部位降糖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也為從調(diào)控糖異生的角度出發(fā)來治療糖尿病提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。但這些成分是通過何種機(jī)制調(diào)控肝臟糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK的表達(dá)發(fā)揮作用，以及其體內(nèi)藥效和安全性均需進(jìn)一步研究。