蔣詩林，葉宇歆，沈 娟，朱家勇，金小寶

(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006)

金黃色葡萄球菌危害著人們的生命健康，是一種常見人體致病菌，可導致心內膜炎、皮膚以及軟組織感染等諸多疾病。由于抗生素的濫用引起耐藥菌的出現(xiàn)(畢振飛等，2015)，其中就包含有對甲氧西林產(chǎn)生耐藥的金黃色葡萄球菌，在臨床上的檢出率較高，其引起的嚴重感染，是臨床治療的難點之一(劉曉瑜等，2015)，這兩種病原菌引起的疾病是人們急需解決的健康問題。

美洲大蠊是自然環(huán)境中的一種古老的昆蟲，是傳統(tǒng)的昆蟲類中藥材(高潔等，2018)，其長期生存在遍布病原微生物的垃圾堆和污水池等惡劣環(huán)境中，有很強的生存和抗疾病能力(徐毅，2015；Adenusietal.，2018)，文獻報道其腸道內生活著大量的共生微生物(陳啟亮等，2015)，其抗病能力可能與腸道內的共生菌群相關聯(lián)。放線菌廣泛存在于自然界中，有研究表明其能產(chǎn)生多種抗菌次級代謝產(chǎn)物，以往的研究往往針對土壤環(huán)境中的放線菌，分離得到新型化合物的幾率逐年降低(胡松英等，2011)，因此尋找新的特境放線菌資源更具有研究價值。本課題組已從美洲大蠊腸道分離得到159株內生放線菌(方霞等，2016)，本文將金黃色葡萄球菌和MRSA等兩種人體常見致病菌作為指示菌，利用瓊脂擴散法檢測這159株腸道內生放線菌是否具有體外抗菌活性，隨后用分子生物學方法對目標放線菌進行分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1放線菌庫和指示病原菌

本研究159株放線菌從美洲大蠊腸道分離得到(方霞等，2016)，置于-80℃存于無菌甘油密閉保存。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC25923)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，ATCC25213)采購自廣東省微生物研究所。

1.1.2培養(yǎng)基

菌株采用高氏合成Ⅰ號培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)進行劃線分離，分離培養(yǎng)基中加入了65 μg/mL的重鉻酸鉀防止其他細菌的干擾；將菌株接種到高氏合成Ⅰ號培養(yǎng)基進行純化，并將純化過的放線菌置于高氏合成Ⅰ號培養(yǎng)基上保存；種子培養(yǎng)基：酵母提取物2 g，胰蛋白胨12 g，葡萄糖10 g，無菌水1 000 mL，pH 7.2～7.4；采用鏈霉菌培養(yǎng)基2號(ISP-2)用于發(fā)酵培養(yǎng)，ISP-2：葡萄糖4 g，麥芽提取物10 g，酵母提取物4 g，無菌水1 000 mL，pH7.2～7.4；LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，無菌水1 000 mL；LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入20 g的瓊脂。

1.1.3主要實驗試劑及儀器

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)；Taq PCR Master mix、DNA Marker(日本TaKaRa公司)。臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)；PCR儀(美國Bio-Rad公司)；GelDoc凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1美洲大蠊腸道159株內生放線菌的抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的測定

用接種環(huán)將159株放線菌在高氏一號平板上劃線，將平板培養(yǎng)7 d，依次挑取各單菌落，將菌落接種到100 mL的種子培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫搖床中，以180 r/min搖瓶培養(yǎng)2 d，然后將菌株的種子液以5%的接種量轉接到ISP-2中，發(fā)酵培養(yǎng)條件為180 r/min、28℃搖瓶發(fā)酵7 d，待菌株發(fā)酵完成，將菌株發(fā)酵液以4 000 r/min離心30 min，棄菌絲體，收集發(fā)酵液上清液用于后期實驗(陳雨晴等，2014)。運用瓊脂擴散法中的牛津杯法(佘之蘊等，2016)測定各菌株發(fā)酵液抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性：將金黃色葡萄球菌和MRSA分別接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床中，以180 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 h，各取150 μL菌液加入100 mL LB培養(yǎng)基，混合均勻后倒板。將培養(yǎng)基置于室溫中冷卻，隨后將牛津杯平穩(wěn)地放置在平板上，各牛津杯孔中依次添加200 μL收集來的各菌株的發(fā)酵液上清液，吸取等體積的液體空白培養(yǎng)基作為陰性對照，分別以50 μL 64 μg/mL的氨芐青霉素鈉和50 μL 256 μg/mL的鹽酸萬古霉素作為陽性對照。將平板置于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈(梁大敏等，2019)，并用直尺測量抑菌圈的直徑。

1.2.2細菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析

選擇具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的放線菌，依次提取各放線菌的基因組DNA，用通用保守引物27f和1492r對目標菌株的16S rRNA基因擴增，通用引物(Passarietal.，2015)(27f為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492r為TACGGC TACCTTGTTACGA CTT)由上海英濰捷基公司設計完成。50 μL PCR擴增反應體系：Taq PCR Master mix 25 μL，上游、下游引物各2.5 μL，模板DNA 2.0 μL，高壓滅菌ddH2O 18 μL，同時設立空白對照組(模板DNA用無菌ddH2O代替)，上述過程均確保在無菌環(huán)境下操作。PCR擴增反應條件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 70 s，72℃ 30 s，反應35個循環(huán)；72℃延伸5 min，將擴增產(chǎn)物放置4℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，委托上海生物工程有限公司進行擴增產(chǎn)物的基因測序。

1.2.3菌株16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析以及BLAST同源性比對

將測序所得序列輸入NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中，將各菌株序列進行BLAST同源性對比，獲得同源性較高的菌株，隨后選用MEGA 5.0(Tamuraetal.，2011)軟件中的Neighbor Joining進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析(Scholz，2016)，自展檢驗(bootstrap)重復抽樣1 000次，以評估系統(tǒng)進化樹的拓撲結構穩(wěn)定性，發(fā)育樹各節(jié)點數(shù)值代表自展的重復比例。

1.2.4菌株抗生素合成關鍵酶基因和鹵化酶基因的鑒定

參考Izumikawa等(Izumikawaetal.，2003；Hornungetal.，2007；王海強等，2017)的方法，在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索Helogebase、非核糖體多肽合成酶和多聚酮合酶的相關氨基酸序列，利用Clustal W軟件對其進行對比后，使用軟件Primer 5.0設計引物，隨后用DNAman軟件對引物進行功能評估，獲得2個關鍵次級代謝生物合成基因NRPS (A3F:GCSTACSYSATSTACACSTCSGG;A7R:SASGTCVCCSGTSCGGTAS)、PKS I(K1F: TSAA GTCSAACATCGGBCA;M6R:CGCAGGTTSCSGTA CCAGTA)和鹵化酶基因FADH2(Halo-B4-FW:TTCCCSCGSTACCASATCGGSGAG; Halo-B4-RV: GS GGGATSWMCCAGWACCAS CC)的PCR擴增引物序列。根據(jù)Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書方法，依次提取各放線菌的基因組DNA，并分別對2個關鍵合成酶基因和鹵化酶基因FADH2進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

2 結果與分析

2.1 對金黃色葡萄球菌和MRSA有拮抗作用的放線菌的篩選結果

159株放線菌中有49株放線菌能夠抑制金黃色葡萄球菌和MRSA的活性，49株放線菌中鏈霉菌屬有36株，占73.47%，為優(yōu)勢菌屬；其余13株放線菌隸屬于6個菌屬，分別為戈登氏菌屬、微桿菌屬、短狀桿菌、分枝桿菌、無色桿菌屬和小單孢菌屬。其中，能夠抑制金黃色葡萄球菌生長的內生放線菌有44株，能夠抑制MRSA生長的為16株。有11株內生放線菌對兩種細菌均有拮抗作用，分別是WA4-31、WA12-1-1、WA5-4-31、WA22-1-2、WA2-34、WA22-2-1、WA23-2-1、WA12-1-21、WA12-1-25、WA20-4-6、WA23-1-4，測量11株放線菌的抑菌圈直徑，對金黃色葡萄球菌和MRSA抑制作用最強的分別為WA12-1-1(15.63±0.57 mm)和WA22-1-2(15.23±0.21 mm)，實驗結果見圖1、圖2、表1和表2。

圖1 美洲大蠊部分腸道內生放線菌在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上的形態(tài)學觀察Fig.1 Morphological observation of some endophytic actinomycetes of Periplaneta americana on Gaoshi I Medium注：A～H分別為菌株WA23-2-1、WA22-1-2、WA12-1-21、WA2-7、WA22-2-1、WA5-2-37、WA5-4-31、WA5-1-29。Note:A～H were strains WA23-2-1、WA22-1-2、WA12-1-21、WA2-7、WA22-2-1、WA5-2-37、WA5-4-31、WA5-1-29.

圖2 美洲大蠊部分腸道內生放線菌體外抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性篩選實驗結果Fig.2 Screening results of in vitro anti-Staphylococcus aureus and MRSA activity of some endophytic actinomyc-tesfrom the guts of Periplaneta americana注：A，1～4分別為5-2-24、22-1-2、5-2-37、23-2-1發(fā)酵液上清液對金黃色葡萄球菌的作用結果，空白為空白對照(等量液體空白發(fā)酵液)，陽為陽性對照(50 μL 64 μg/mL的氨芐青霉素鈉); B，1～4分別為5-4-31、5-1-7、10-1-6、5-2-40發(fā)酵液上清液對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的作用結果，空白為空白對照(等量液體空白發(fā)酵液)，陽為陽性對照(50 μL 256 μg/mL的鹽酸萬古霉素)。Note: A，1～4 were the effects of 5-2-24，22-1-2，5-2-37，23-2-1 fermentation broth supernatant on S.aureus，blank is blank Control (equal liquid blank fermentation broth)，positive as positive control (50 μL of 64 μg/mL ampicillin sodium); B，1～4 were the effects of 5-4-31，5-1-7，10-1-6，5-2-40 fermentation broth supernatant on Methicillin-resistant S.aureus(MRSA)，blank is blank Control (equal liquid blank fermentation broth)，positive as positive control(50 μL of 256 μg/mL vancomycin hydrochloride).

表1 具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的49株美洲大蠊腸道內生放線菌的抗菌情況

表2 11株具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性放線菌的抑菌圈結果

2.2 11株放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹構建、BLAST同源性對比和分子生物學鑒定

將對金黃色葡萄球菌和MRSA具有抑制作用的菌株16S rRNA基因序列輸入NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中，運用BLAST程序進行同源性對比，11株菌分別屬于戈登氏菌屬、微桿菌屬、無色桿菌屬和鏈霉菌屬。選取親緣性最高的菌株序列，利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果見圖3，進一步驗證WA4-31為戈登氏菌，WA12-1-21、WA12-1-25為微桿菌，WA5-4-31為無色桿菌，WA22-1-2、WA2-34、WA22-2-1、WA20-4-6、WA12-1-1、WA23-1-4、WA23-2-1為鏈霉菌，且分別與土壤中的戈登氏菌屬、微桿菌屬、無色桿菌屬和鏈霉菌屬親緣關系較近。

圖3 抑制兩種細菌生長的11株內生放線菌的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 16S rRNA gene sequence phylogenetic tree analysis of the 11 strains of Actinomycetes with anti-Staphylococcus aureus and MRSA activity

2.3 11株放線菌部分抗生素合成關鍵酶基因的篩選結果

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示(表3)，有9株放線菌檢測到鹵化酶基因FADH2(約700 bp)，有7株放線菌檢測到兩種關鍵酶基因NRPS(約900 bp)和PKS I(約750 bp)中的一種或兩種。另外WA2-34、WA12-1-1、WA12-1-21、WA20-4-6、WA22-1-2、WA22-2-1均檢測到兩種關鍵酶基因和鹵化酶基因FADH2。

表3 11株具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性菌株部分抗生素合成關鍵酶基因的篩選結果

3 結論與討論

金黃色葡萄球菌可造成普遍的臨床感染，它是感染性心內膜炎和菌血癥以及骨關節(jié)，皮膚和軟組織等相關感染的主要病因(Tongetal.，2015)。由于臨床上抗生素使用的不合理性，導致細菌的耐藥性問題愈發(fā)緊迫(趙艷坤等，2018)。MRSA引起的健康問題愈發(fā)嚴重，與越來越多的感染相關，影響了全球人類的健康，且通常具有多重耐藥。在臨床實踐中，MRSA構成了主要威脅，顯著增加了感染發(fā)病率，死亡率和整體醫(yī)療費用(Bassettietal.，2019；Emeka-Nwabunniaetal.，2019)，因此迫切需要開發(fā)新型廣譜抗生素來對抗頻繁出現(xiàn)的多重耐藥病原體(Senguptaetal.，2015)。昆蟲與微生物之間的共生相互作用是自然界中廣泛存在的，微生物共生體能夠產(chǎn)生具有抗菌活性的物質，為宿主提供化學防御，用以抵抗病原體(Aileenetal.，2016；Arangoetal.，2016)。美洲大蠊是已知的最古老的有翅昆蟲之一，具有很強的適應各種復雜環(huán)境的能力(Zhangetal.，2016)，由于其生長環(huán)境的特殊性，其腸道內共生菌可能產(chǎn)生抗菌活性物質幫助其增強對有害病原菌的抵抗力。

在生物活性物質的天然生產(chǎn)者中，放線菌是藥物應用中新的抗生素的主要來源(Jakubiec-Krzesniaketal.，2018)，尤其是放線菌中的鏈霉菌屬，提供了在現(xiàn)在臨床中使用的60%以上的抗生素(Esnaultetal.，2017)。本研究前期從美洲大蠊腸道分離獲得159株內生放線菌，本研究在此基礎上對上述菌株的抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性進行了分析，結果顯示30.82%(49株)的內生放線菌對金黃色葡萄球菌和MRSA表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，這49株放線菌包含有鏈霉菌屬、戈登氏菌屬、微桿菌屬、短狀桿菌屬、分枝桿菌屬、無色桿菌屬和小單孢菌屬，其中 WA4-31、WA22-1-2、WA2-34、WA22-2-1、WA23-2-1、WA12-1-21、WA5-4-31、WA12-1-25、WA20-4-6、WA12-1-1、WA23-1-4等11株美洲大蠊腸道共生放線菌對兩種細菌均有抗菌活性。推測這些放線菌中有可能產(chǎn)生具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的新的天然產(chǎn)物，尤其是對兩株病菌均具有抗性的放線菌。許多具有重要藥用研究價值的微生物次級代謝產(chǎn)物的合成往往需要通過非核糖體多肽合成酶和聚酮合酶共同參與形成結構模塊，隨后通過FADH2-依賴性鹵化酶催化，從而形成具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物(Neumannetal.，2008；薛永常等，2014；滕安然等，2019)。具有多種抗菌活性的放線菌具有很高的研究價值，值得優(yōu)先研究，因此，本實驗對11株放線菌的關鍵酶基因PKS I、NRPS和FADH2-依賴性鹵化酶基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)WA2-34、WA12-1-1、WA12-1-21、WA20-4-6、WA22-1-2、WA22-2-1均檢測到兩種關鍵酶基因和鹵化酶基因FADH2，說明這6株放線菌有分泌聚酮類和非核糖體肽類化合物的潛力?，F(xiàn)在已知的抗生素大部分產(chǎn)自鏈霉菌，但隨著研究的深入，從鏈霉菌中分出新型抗生素的幾率越來越少(袁麗杰等，2012)。戈登氏菌屬、微桿菌屬、短狀桿菌屬、分枝桿菌屬、無色桿菌屬和小單孢菌屬是放線菌中的稀有菌屬，針對這類菌群的抗菌活性的研究較少。例如有關戈登氏菌屬的研究多與其生物降解能力相關(Liu Netal.，2020)，鮮有研究其發(fā)酵產(chǎn)物的抗金黃色葡萄球菌和MRSA的作用，而且這4株稀有放線菌中的WA5-4-31和WA12-1-25對MRSA和金黃色葡萄球菌均有較強的抗菌活性。因此研究11株放線菌中的稀有菌屬，有可能分出具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的新穎的化合物。下一步實驗擬重點對這11株放線菌中的4株稀有菌屬進行研究，運用硅膠柱層析、半制備高效液相、核磁共振、質譜等現(xiàn)代波譜技術對這些放線菌的次級代謝產(chǎn)物進行分析研究，以期獲得具有良好的抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的新天然產(chǎn)物。

本研究在對159株美洲大蠊腸道內生放線菌的研究中發(fā)現(xiàn)30.82%放線菌的次級代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和MRSA可產(chǎn)生不同程度的拮抗作用，其中有22.45%(11株)放線菌對2種指示病原菌均有不同程度的抑制作用，且11株放線菌中有4株放線菌為稀有菌屬，揭示了美洲大蠊腸道內生放線菌具有產(chǎn)生活性次級代謝產(chǎn)物的潛力。