王淑穎，曹成全，鄭燦平，賀佳倩，袁靖澤，葉保華*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，山東泰安 217018；2. 樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614004；3. 山東農(nóng)業(yè)大學科技處，山東泰安 217018；4. 吉首大學生物資源與環(huán)境工程學院，湖南吉首 416000)

廣翅目Megaloptera分為齒蛉科Corydalidae和泥蛉科Sialidae 2科，齒蛉科含有26屬235種及6亞種(劉星月, 2008; 楊定和劉星月, 2010)。廣翅目齒蛉科的巨齒蛉屬Acanthacorydalis和大型齒蛉屬Neoneuromus的幼蟲被民間稱為“爬沙蟲”(曹成全, 2014)，是一種珍稀的藥食兩用昆蟲，在四川攀西地區(qū)等廣大區(qū)域具有上百年的食用歷史(曹成全, 2019)，治療小兒夜尿、老人尿頻、治療體虛等如有神效(四川省鹽邊縣政協(xié)文史資料編委會, 1990)，且具有其他很多藥理作用(楊冬梅等, 2012; 石晏丞等, 2019)。

在產(chǎn)業(yè)化應用的過程中，爬沙蟲的幼蟲是主要產(chǎn)品蟲態(tài)，因此，之前的研究中，中國有巨齒蛉屬(東方巨齒蛉Acanthacorydalisorientalis(McLachlan, 1899))和齒蛉屬(普通齒蛉NeoneuromusignobilisNavás, 1932和錫金齒蛉Neoneuromussikkimmensis(van der Weele, 1907))末齡幼蟲和蛹的形態(tài)描述(Cao and Liu, 2013; Caoetal., 2016; Caoetal., 2018)。卵塊和1齡幼蟲作為引種的重要蟲態(tài)，其形態(tài)鑒定是爬沙蟲人工繁育和產(chǎn)業(yè)化應用過程中的重要工作。

本文選取了齒蛉科的中國特有種普通齒蛉和單斑巨齒蛉AcanthacorydalisunimaculataYangetYang，1986作為齒蛉屬和巨齒蛉屬(爬沙蟲的主要類群)的代表，對其卵塊和1齡幼蟲進行了形態(tài)描述和比較。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2019年7-8月，在四川省樂山市峨眉山(N 29°37′26″, E 103°23′31″)、貴州凱里三棵樹鎮(zhèn)(N 26°34′1″, E 108°03′44″)，每個種分別采集至少50個健康卵塊，妥善帶回實驗室進行研究，并按照相關(guān)專利技術(shù)進行孵化(曹成全, 2018)，將每個種的卵塊逐個放置在貼標簽的孵化槽里，孵化出1齡幼蟲。

1.2 物種分子鑒定

1.2.1DNA提取

將1齡幼蟲剪取胸腹部肌肉，取完后用消毒后的小剪刀剪碎，再采用基因組DNA試劑盒(北京天根生物科技)提取總的基因組DNA。

1.2.2PCR擴增以及測序

擴增引物COI序列通用為C1-J-2183 (5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′)和TL2-N-3014 (5′-TCCATTGCACTAATCTGCCATATTA-3′)(張杰, 2017)。整個PCR反應體系為25 μL，包括2×ES Taq Master Mix (cye)12.5 μL，引物各取了1.0 μL (0.4 μmol)，ddH2O 8.5 μL，樣品2 μL。擴增程序為94℃，1 min；94℃，0.1 min，55-0.5℃，0.5 min，72℃，1 min，20 cycles；94℃，0.5 min，45℃，0.5 min，72℃，1 min，20 cycles；72℃，10.0 min，4℃，1 cycles(注：ES Taq DNA Polymcrase擴增效率為2 kb/min)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產(chǎn)物再送至生工生物技術(shù)中(上海)公司成都生工測序部進行純化和雙向測序。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

接收到公司測出的樣本序列，然后在Genbank上對比得出樣本(1齡幼蟲)種類，并推論出相對應的卵塊種類。

1.3 形態(tài)測定方法和數(shù)據(jù)處理

利用游標卡尺測量卵塊的長、寬、高，然后在LY-WN超清顯微系統(tǒng)(成都勵揚精密機電有限公司)下進行拍照，并用Photoshop和Illustrator軟件處理照片。每個物種的1齡幼蟲取30頭，放在DW-25L262型醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)內(nèi)-22℃冰凍5 min至死亡，待其自然伸展，在體視顯微鏡(SDPYOP SZM)下調(diào)整姿勢后，放在LY-WN超清顯微系統(tǒng)下進行拍照。最后利用ToupView軟件將照片按照相應的分辨率測量卵塊和1齡幼蟲各部位細微長度。采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種鑒定結(jié)果

將測序的DNA序列與Genbank上廣翅目已測物種基因序列對比，確定本研究的物種為普通齒蛉NeoneuromusignobilisNavás，1932和單斑巨齒蛉AcanthacorydalisunimaculataYangetYang，1986。

2.2 普通齒蛉的卵塊及1齡幼蟲形態(tài)描述

2.2.1卵塊及卵粒的形態(tài)特征

普通齒蛉卵塊有多種類型(圖1)，可分為橢圓形(圖1-A)、螺形(圖1-B)、卵圓形(圖1-C)、圓形(圖1-D)。其中，橢圓形類型最多，占采集全部卵塊的47.1%；其次是圓形，占25.5%；卵圓形占17.6%，最少的是螺形，只占9.8%。卵塊的形狀受附著的蘆葦葉的寬度的影響(圖3)，在采集的卵塊中，70.6%卵塊底部寬大于等于附著的蘆葦葉寬，其上卵塊細長，呈橢圓形、螺形、卵圓形(圖3-B，C，D)，29.4%是卵塊底部寬小于蘆葦葉寬，卵塊呈圓形(圖3-A)，成蟲可以在充足的空間進行產(chǎn)卵。最外層卵粒上覆一層白色物質(zhì)，不同類型白色覆蓋物厚度分布差異不大，通常情況下，白色覆蓋物兩頭厚1.44±0.06 mm，周邊略薄為0.53±0.06 mm，兩頭厚度是兩側(cè)2～3倍。以比重最大的橢圓形類型為例，一般情況下，卵塊的長度為17.96±2.36 mm，寬度為13.45±1.82 mm，高度為6.74±1.13 mm。卵塊底面由8層卵粒構(gòu)成，每層卵粒排列呈橢圓形向內(nèi)部集中。卵粒從卵塊一側(cè)開始向外部呈射線分布層層有規(guī)律地緊密的排列在一起(圖4-A)。卵塊側(cè)面由5層組成，每層卵粒朝著卵塊側(cè)邊底部集中，彼此緊密相連，尤其在其側(cè)邊緣。底面三層卵粒呈水平狀，側(cè)邊緣呈弧形，整體構(gòu)成半圓環(huán)形(圖4-B)。一般卵塊約有700～1 000個卵粒。卵粒之間有白色的、質(zhì)軟的泡沫狀卵囊，有緩沖的作用，避免因擠壓等外力作用損壞卵粒，孵化后的卵殼呈蜂窩狀，呈乳白色，易脫落(圖2-D)。卵粒的形狀呈圓柱形，兩端鈍圓，呈淡黃色，在卵的半徑面上并無大頭針狀物質(zhì)。卵粒大小幾乎相等，長為1.17±0.04 mm，寬為0.36±0.02 mm，長寬比約為3 ∶1。在卵塊孵化過程中，卵粒會在同一側(cè)前端最先出現(xiàn)黑色眼點，隨著時間推移，表皮開始皺縮，卵粒顏色會由金黃色逐漸向黑褐色轉(zhuǎn)變(圖5)，卵塊孵化整個過程大概為18 d左右。

圖1 普通齒蛉卵塊類型Fig.1 Egg mass types of Neoneuromus ignobilis注：A，橢圓形；B，螺形；C，卵圓形；D，圓形；從左往右依次是其類型的背面、腹面、側(cè)面。Note: A, Oval; B, Spiral; C, Egg-shape; D, Circle; From left to right were the back, ventral and lateral sides of the egg mass type.

圖2 普通齒蛉卵粒和卵殼Fig.2 Eggs and their mass of Neoneuromus ignobilis注：A，背面卵粒；B，腹面卵粒；C，單個卵粒；D，孵化后的卵塊。Note: A, Eggs in the dorsal view; B, Eggs in the ventral view; C, A single egg; D, Egg mass after hatching.

圖3 蘆葦葉上的不同普通齒蛉卵塊Fig.3 Different egg mass of Neoneuromus ignobilis on reed leaves

圖4 普通齒蛉卵塊模式圖Fig.4 Pattern of egg mass of Neoneuromus ignobilis注：A，腹面圖；B，切面圖。Note: A, Ventral view; B, Sectional drawing.

圖5 普通齒蛉卵塊孵化過程中顏色變化Fig.5 Color changes during the hatching process of egg mass of Neoneuromus ignobilis注：A，第1天；B，第8天；C，第15天；D，第16天。Note: A, First day; B, Eighth day; C, Fifteenth day; D, Sixteenth day.

2.2.21齡幼蟲的形態(tài)特征

普通齒蛉的1齡幼蟲(圖6-A，B)體型扁長，整體呈透明狀，可以清楚地看出體內(nèi)脂肪及兩側(cè)氣管，體長為3.82±0.04 mm，體寬為0.56±0.01 mm。頭部寬0.60±0.01 mm，頭部長0.67±0.01 mm。眼點明顯，呈黑色，位于頭部兩側(cè)。頭部兩側(cè)有一對上顎，上顎上有4個齒，每個齒前端呈棕黃色，下端呈透明。大顎外側(cè)是觸角，共有3節(jié)，各節(jié)長度不一，其中基部柄節(jié)最粗短，為0.02 mm；梗節(jié)為0.16 mm，棒狀，與柄節(jié)相連一端到1/2處呈黃褐色，與鞭節(jié)相連一端呈透明，較為粗大；鞭節(jié)最長，為0.17±0.01 mm，細長，呈黃褐色，向端部逐漸變細。前胸呈長方形，長0.56±0.01 mm，寬0.55±0.02 mm，明顯比中后胸大，胸部背板骨化較強。從中胸到尾部，在其腹部背面呈棕黃色，且有白色的帶狀裸露區(qū)，外側(cè)裸露區(qū)一般排列成一對絲條狀，內(nèi)側(cè)裸露區(qū)呈一對狹窄的帶狀。1齡幼蟲一共有10腹節(jié)，前8腹節(jié)兩側(cè)都有一條氣管鰓，每條氣管鰓長度相似，約為0.64±0.09 mm，透明狀，每條氣管鰓靠近尾端都有黃褐色斑點；第10腹節(jié)有一對尾鉤，黃褐色。約14 d后，1齡幼蟲會從前胸背板處破皮而出，蛻皮為2齡幼蟲，蛻皮完整，兩側(cè)有明顯的氣管(圖6-C)。2齡幼蟲頭部皆為黃色，腹部氣管鰓旁出現(xiàn)細絲狀毛簇，每個部位有兩簇，每簇三條，共6條毛簇(圖6-D)。

圖6 普通齒蛉1齡幼蟲Fig.6 First-instar larvae of Neoneuromus ignobilis注：A，背面觀；B，腹面觀；C，蛻皮；D，2齡幼蟲。Note: A, Dorsal view; B, Ventral view; C, Molting; D, Second-instar larvae.

2.3 單斑巨齒蛉的卵塊及1齡幼蟲形態(tài)描述

2.3.1卵塊及卵粒的形態(tài)特征

單斑巨齒蛉卵塊有單個的，呈卵圓形(圖7-A，D)，一頭大一頭?。坏灿袃蓧K相連的卵塊，呈葫蘆狀(圖7-B，E)，兩邊呈波浪形。卵粒底面卵塊一側(cè)1/4處開始向外部呈射線分布層層有規(guī)律地緊密的排列在一起，有9層(圖8-A)。卵塊側(cè)面扁長，由6層組成，每層卵粒朝著卵塊側(cè)邊中部集中，彼此緊密相連(圖8-B)。卵塊最外層卵粒一側(cè)向內(nèi)，一側(cè)翹向外，其上覆有一層薄薄的白色物質(zhì)，在0.27±0.05 mm，卵塊背面可以清楚地顯出最外層卵粒向外翹起的排列，使得卵塊表面看上去如許多大小相似橢圓形的突起均勻地分布在表面，顏色呈暗白色。卵粒細長,呈圓柱狀，黃白色，卵粒端鈍圓(圖7-C),一般卵塊約有1 200～1 500粒卵塊。卵塊長為21.02±2.58 mm，寬為15.22±3.29 mm,高為5.73±0.54 mm。卵粒長1.89±0.03 mm，寬0.52±0.04 mm，長寬比約為3.5 ∶1，一端鈍圓，一端較尖鈍。卵粒之間存在白色的泡沫狀卵囊，可以起到緩沖保護卵粒的作用，待卵粒完成孵化后，就會剩下泡沫狀卵囊(圖7-F)。

圖7 單斑巨齒蛉卵塊和卵粒Fig.7 Egg mass and eggs grain of Acanthacorydalis unimaculata注：A，單個卵塊背面；B，兩個相連卵塊背面；C，單個卵粒；D，單個卵塊腹面；E，兩個相連卵塊腹面；F，孵化后的卵。Note: A, Dorsal view of a single egg mass; B, Dorsal view of two joined egg masses; C, A single egg grain; D, Ventral view of a single egg mass; E, Ventral view of two joined egg masses; F, Egg mass after hatching.

圖8 單斑巨齒蛉卵塊模式圖Fig.8 Pattern of egg mass of Acanthacorydalis unimaculata注：A，腹面圖；B，切面圖。Note: A, Ventral view; B, Sectional drawing.

2.3.21齡幼蟲形態(tài)學特征

單斑巨齒蛉的1齡幼蟲(圖8)，整體狹長，體長為3.8±0.17 mm ，體寬為0.68±0.03 mm，整體呈透明，可以清楚地看見其內(nèi)部消化道、脂肪等內(nèi)部結(jié)構(gòu)，全身附滿大小長度不一的毛刺。頭長為0.81±0.07 mm，頭寬為0.73±0.05 mm。眼點明顯，呈黑色，位于頭部兩側(cè)偏上部分。上顎共有4齒，大小不同，4個齒的頂端都呈黃褐色，下端呈透明狀。觸角為3節(jié)，長短不一，柄節(jié)為0.03 mm，粗短，位于基部；梗節(jié)為0.20±0.01 mm，棒狀，與柄節(jié)相連一端到1/2處呈黃褐色，與鞭節(jié)相連一端呈透明，較為粗大；鞭節(jié)為0.20±0.01 mm，細長，呈黃褐色，端部為尖。前胸長0.64±0.01 mm，寬0.47±0.01 mm，透明無花紋。從中胸到尾部，其腹部背面呈棕黃色，腹部背面裸露區(qū)位和顏色分布不穩(wěn)定。腹部共有10節(jié)，分節(jié)明顯，前8腹節(jié)每節(jié)兩側(cè)各有一條鞭毛狀細長的氣管鰓，每條氣管鰓長度相似，約為0.64±0.09 mm，內(nèi)部有一條乳白色的氣管，但腹部無毛簇結(jié)構(gòu)。第10腹節(jié)有1對黃色的尾鉤以及一對透明尾須。

單斑巨齒蛉在卵孵化過程中，最先在卵粒窄端1/4處出現(xiàn)黑色眼點，即卵粒窄端為幼蟲頭部端。隨著時間推移，卵粒表皮逐漸皺縮，卵粒顏色也是由金黃色逐漸向黑褐色轉(zhuǎn)變(圖9)，甚至還可以清晰地看見幼蟲黃褐色大顎和尾部(圖9-C)。

圖8 單斑巨齒蛉1齡幼蟲Fig.8 First-lnstar larvae of Acanthacorydalis unimaculata注：A，背面；B，腹面。Note: A, Dorsal view; B, Ventral view.

圖9 單斑巨齒蛉卵過程中內(nèi)部變化Fig.9 Color changes during the hatching process of egg of Acanthacorydalis unimaculata注：A，第1天；B，第8天；C，第15天；D，第16天。Note: A, First day; B, Eighth day; C, Fifteenth day; D, Sixteenth day.

2.4 普通齒蛉與單斑巨齒蛉在卵塊和1齡幼蟲的形態(tài)特征比較

普通齒蛉與單斑巨齒蛉在卵塊和1齡幼蟲的形態(tài)上有著較大差異，可以通過對比進行分類區(qū)分。

對于兩種卵塊區(qū)別最大的地方為普通齒蛉的卵塊是單斑巨齒蛉的卵塊3/4，單斑巨齒蛉的白色覆蓋層比普通齒蛉的薄，再加上最外層卵粒向外伸出，從而使得單斑巨齒蛉卵塊表面看上去是有許多大小相似橢圓形的突起均勻地分布在表面。

對于兩屬卵粒來說，普通齒蛉的卵粒是單斑巨齒蛉的卵粒2/3，普通齒蛉的卵粒數(shù)量在700～1 000粒，單斑巨齒蛉卵粒數(shù)量在1 200～1 500粒，除了大小數(shù)量差異外，其外形和孵化過程都相似，都呈圓柱狀，最初的卵粒都呈黃色，卵塊孵化整個過程都在18 d左右。

對于兩種1齡幼蟲差異來說，主要在于腹部背面裸露區(qū)位置以及有無氣管鰓花斑。單斑巨齒蛉1齡幼蟲腹節(jié)呈深褐色，腹部背面裸露區(qū)和顏色分布不穩(wěn)定，8對氣管鰓靠近末端相同位置無斑點；普通齒蛉的1齡幼蟲腹節(jié)背面呈棕黃色，且白色的線狀裸露區(qū)較穩(wěn)定，外側(cè)裸露區(qū)一般排列成一對絲條狀，內(nèi)側(cè)裸露區(qū)呈一對狹窄的帶狀。每一腹節(jié)都是相似分布，其1齡幼蟲的8對氣管鰓末端相同位置有黃褐色花斑。

表1 普通齒蛉與單斑巨齒蛉卵塊和1齡幼蟲形態(tài)特征的比較

3 結(jié)論與討論

通過之前研究發(fā)現(xiàn)炎黃星齒蛉ProtohermesxanthodesNavás，1913、角新齒蛉Corydaluscornutus(Linnaeus)、全色新魚蛉Neohermesconcolor等卵粒半徑偏中心處均有個大頭針狀物(Baker and Neunzig, 1968; 陳申芝, 2012)，而普通齒蛉和單斑巨齒蛉的卵粒均無此結(jié)構(gòu)。推測不同種屬的廣翅目昆蟲的卵粒是存在外部差異的，這需要進一步對廣翅目多個種屬進行深入研究，將對廣翅目分類具有一定的參考價值。

普通齒蛉的卵塊基本是單個附著在蘆葦葉上，通過觀察其卵塊多種形態(tài)與其接觸的蘆葦葉寬度有關(guān)。在采集的卵塊中，70.6%的卵塊底部寬大于等于蘆葦葉寬度，其形狀為橢圓形、螺形、卵圓形，還有29.4%的卵塊底部寬小于等于蘆葦葉寬度，卵塊形狀呈圓形。由此可見，普通齒蛉產(chǎn)卵時會在蘆葦葉的寬度范圍內(nèi)，充分利用蘆葦葉的寬度。鋸角黑魚蛉Nigroniaserricornis(Say)也是如此，其喜在特定樹種上產(chǎn)卵，并且種內(nèi)不同個體在選擇產(chǎn)卵葉片的長寬和高度上存在差異(Pennuto and Stewart, 2001)，雌蟲對產(chǎn)卵地點的選擇可能與卵的保護及提高卵的孵化率有關(guān)(劉星月, 2008)，具體關(guān)系還需要進一步統(tǒng)計分析。單斑巨齒蛉的卵塊則是多個相連附著在橋底，可能由于產(chǎn)卵雌蟲數(shù)量較多和產(chǎn)卵地點面積大小所限制，導致卵塊呈多個相連一起，但也有可能是由于同一雌蟲產(chǎn)多個卵塊。產(chǎn)卵量在不同種間及不同個體間存在一定的差異，通常情況下1頭雌蟲至少可以產(chǎn)下1個卵塊，但有時可能產(chǎn)多塊，如大星齒蛉Protohermesgrandis(Thunberg)和美星齒蛉ProtohermesimmaculatusKuwayama的雌蟲可以產(chǎn)1～4個卵塊(劉星月, 2008)。導致單斑巨齒蛉的卵塊多個相連是由于空間密度問題還是雌蟲產(chǎn)多個卵塊相連，需要進一步對其產(chǎn)卵行為進一步探索。

普通齒蛉與單斑巨齒蛉的卵塊最外層都是白色物質(zhì)包裹內(nèi)部卵粒，其他種類如大星齒蛉Protohermesgrandis(Thunberg)和美星齒蛉、美洲的角新齒蛉的卵表面都有這樣的白色或褐色的覆蓋物(Hayashi, 1992; Mangan, 1992)，這類覆蓋物的作用可能與卵的保護與保水有關(guān)(劉星月, 2008)。但也有些卵塊是裸露的，表面無覆蓋物，如炎黃星齒蛉、櫛角魚蛉Chauliodespectinicornis(Linnaeus)、鋸角黑魚蛉(Baker and Neunzig, 1968; Pennuto and Stewart, 2001; 陳申芝等, 2012)。卵塊外表面有無白色覆蓋物能否成為廣翅目分類的標準，還需要大量的工作進行研究。另外，外層白色或褐色的覆蓋物與葉蟬(半翅目：葉蟬科)蟲體外表白色物質(zhì)相似，葉蟬是從馬氏管產(chǎn)生并在后腸蛻皮后分泌，再通過后足將其涂抹蟲體外表，其主要物質(zhì)是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，達到防水、防菌、減少水分蒸發(fā)等作用(Rakitov, 2009)。目前還未有關(guān)對廣翅目白色覆蓋物的相關(guān)研究，對于其是如何形成、分泌等機理值得進一步研究。

對于大齡幼蟲來說，兩種爬沙蟲每一腹節(jié)兩側(cè)都有一對毛簇進行張閉合呼吸，一共7對(Cao, 2018)，而通過對兩種爬沙蟲1齡幼蟲的比較，發(fā)現(xiàn)兩種爬沙蟲的1齡幼蟲腹面腹節(jié)處皆無毛簇，且發(fā)現(xiàn)毛簇是在2齡開始才出現(xiàn)毛簇，且與大齡幼蟲的毛簇不太相同，呈細絲狀，位于呼吸鰓下端?？梢?，毛簇的發(fā)育過程是逐步變化的，下一步會對其發(fā)育過程進行詳細研究。

總之，通過對普通齒蛉和單斑巨齒蛉卵塊與1齡幼蟲的形態(tài)特征描述以及比較，可以在售賣卵塊和種苗(1齡幼蟲)時可以簡單進行判別，對產(chǎn)業(yè)化具有一定參考價值，但目前研究種類有限，可能會與其他種類發(fā)生混淆，接下來需要對廣翅目其他種屬的卵塊和1齡幼蟲的形態(tài)學特征比較研究，這將對廣翅目分類以及廣翅目產(chǎn)業(yè)化做出巨大貢獻。對于卵和外層白色覆蓋物的化學和營養(yǎng)成分及其開發(fā)等還需進一步研究。

致謝：感謝樂山師范學院生命科學學院2015級生物技術(shù)班李旭月同學對本實驗的貢獻。