高玲 王斐 謝雙全 陳喜鳳 沈海濤 李鴻彬

（石河子大學生命科學學院，石河子 832003）

烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis）是一種重要的藥用植物，對干旱、鹽堿等逆境脅迫具有較強的耐受性［1］。

次生代謝物質是甘草的主要藥用成分，其含量與甘草的生長環(huán)境緊密相關。研究表明，適度的干旱脅迫能夠促進甘草中甘草苷、甘草酸等有效成分的積累［2］；鹽脅迫能夠通過抑制初生代謝和促進次生代謝，使得甘草酸和甘草苷相對含量增加［3］；甘草根中甘草苷、甘草酸銨和甘草次酸的含量在增強UV-B輻射下有顯著升高的趨勢［4］；適當濃度的赤霉素GA3和茉莉酸甲酯MeJA處理能夠顯著促進甘草有效成分的積累及其生物合成途徑相關基因的表達［5-6］。

植物鈣調磷酸酶B類蛋白CBL是一類重要的Ca2+傳遞類傳感蛋白。CBL蛋白具有保守的4個EF結構域，與鈣離子結合后，通過與下游蛋白CIPK（CBL-interaction protein kinase）相互作用介導鈣信號向下游傳遞，參與植物生長發(fā)育調控及應對外界各種逆境信號的轉導［7-8］。目前已從擬南芥、水稻和楊樹基因組中分別鑒定得到10個CBL基因［9］，此外，在高粱（6個）、葡萄（8個）、苔蘚（4個）及蕨類（4個）等不同植物中均有關于CBL成員的報道［10］。植物CBL基因在調節(jié)植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要功能。擬南芥AtCBL1在高鹽、干旱、低溫和傷害等非生物脅迫下被誘導表達［11-13］。AtCBL2和AtCBL3不同程度的受光誘導表達［14］。低鉀脅迫下，擬南芥CBL1/CBL9通過與CIPK23作用調控質膜上鉀離子通道蛋白AKT1的活性［15］；玉米ZmCBL4顯著提高轉基因擬南芥的耐鹽性［16］；陸地棉GhCBL2和GhCBL3在調節(jié)棉纖維的伸長方面發(fā)揮重要作用［17］。烏拉爾甘草非生物脅迫細胞生理學研究表明適度逆境脅迫一定程度上促進了甘草藥用有效成分的累積［18-24］。

目前，關于烏拉爾甘草CBL基因家族的研究未見報道。本研究利用生物信息學方法從烏拉爾甘草全基因組中鑒定得到10個GuCBL基因，并對這些基因的染色體分布、基因結構和基序、進化關系和順式作用元件進行了系統(tǒng)分析，研究GuCBL的組織特異性和響應非生物脅迫的表達特征，為深入研究GuCBL在生長發(fā)育和逆境應答中的功能和調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

甘草品種為野生藥用烏拉爾甘草，由石河子大學甘草研究所保存。甘草種子用98% H2SO4浸泡處理25 min，無菌水沖洗3次，0.1% HgCl2消毒7 min后播種至基質盆缽內，溫度為28℃白天/25℃黑夜，光照周期為16 h光照/8h/黑暗進行蛭石培養(yǎng)45 d。收集同一時期烏拉爾甘草根、莖和葉片組織，置于-80℃?zhèn)溆?。選擇長勢一致的約45 d的烏拉爾甘草幼苗移至300 mL的水培瓶中，用1×Hoagland（去除Na+）營養(yǎng)液水培3 d后進行非生物脅迫處理。分別 用 300 mmol/L NaCl、10%（W/V）PEG6000、2%H2O2、4℃和42℃處理模擬鹽、旱、氧化、低溫和高溫脅迫，收集處理后0、6、12和24 h上述處理的根部材料，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 烏拉爾甘草CBL基因家族成員鑒定及生物信息學分析 利用擬南芥10個CBL蛋白序列及大豆12個CBL蛋白序列在烏拉爾甘草基因組中進行比對，去除重復后篩選獲得烏拉爾甘草GuCBL候選基因。利用在線網(wǎng)站http：//www.expasy.org/分析蛋白質序列的長度、分子質量和等電點等信息。利用Softberry網(wǎng) 站http：//linux1.softberry.com/berry.phtml預測亞細胞定位。使用MEGA軟件鄰接法Neighbor-Joining，將烏拉爾甘草、擬南芥、大豆3個物種的CBL基因構建進化樹。使用GSDS工具分析基因結構特征，使用MEME軟件分析蛋白質的保守基序。使用TBtool https：//github.com/CJ-Chen/TBtools軟件繪制GuCBL家族成員在不同Scaffold中的位置及基因間的復制關系。使用ClustalW 2.0對復制的GuCBL的CDS序列進行比對，DnaSP 5.0軟件計算非同義替換Ka、同義替換Ks以及它們之間的比值（Ka/Ks）以評估進化中的選擇壓力；使用Graphics工具分析并繪制烏拉爾甘草與擬南芥、大豆之間CBL基因家族成員的親緣關系及其同源性。利用UGENE軟件從基因組序列中獲取GuCBL上游1 500 bp的啟動子序列，使用PlantCARE軟件http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plancare/html/分析存在的順式作用元件。

1.2.2 基因表達分析 使用TIANGEN公司的RNAPREP PURE PLANT KIT試劑盒提取不同材料總RNA，使用Takara公司高容量ScriptTM RT試劑盒合成cDNA。使用Premier 5.0軟件設計特異性引物（表1）。選擇甘草肌動蛋白基因（GuActin，Genbank：GQ404511）作為內參基因進行歸一化數(shù)據(jù)［25］。使用實時定量PCR檢測GuCBL的表達情況，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，每個測試樣品進行3次重復試驗。相對表達值使用2-△△Ct法計算獲得，熱圖使用MeV軟件進行聚類分析作圖。

2 結果

2.1 烏拉爾甘草CBL家族基因的鑒定

在烏拉爾甘草基因組數(shù)據(jù)庫中共初步鑒定獲得10個CBL成員GuCBL1-GuCBL10（表2）。在這10個GuCBL成員中，GuCBL4、GuCBL7和GuCBL10為拼接錯誤序列，對這些基因進行設計全長引物（表1），進行PCR擴增后獲得了這3個基因的完整全長序列。最終獲得了10個完整的GuCBL成員，分別定位在不同的染色體支架上（圖1）。GuCBL開放閱讀框的范圍為642-1 008 bp，GuCBL蛋白的分子量為24.36-41.46 kD，包含氨基酸數(shù)目為213-364aa，具有的等電點范圍為4.57-5.38，亞細胞定位預測顯示GuCBL蛋白均定位在質膜上，GuCBL蛋白N-末端均含有棕櫚?；稽c，其中，GuCBL5、GuCBL8和GuCBL9還含有豆蔻?；稽c（表2）。

圖1 烏拉爾甘草GuCBL在染色體支架上的分布Fig. 1 Chromosomal scaffold distribution of GuCBL genes in G. uralensis

2.2 烏拉爾甘草GuCBL系統(tǒng)發(fā)育分析

為了解烏拉爾甘草CBL系統(tǒng)進化關系，選擇與擬南芥和大豆的CBL共同構建了系統(tǒng)進化樹。結果顯示，烏拉爾甘草GuCBL可分為A、B、C、D 4個組，分別包括3個（GuCBL2、GuCBL3、GuCBL6）、1個（GuCBL5）、2個（GuCBL1和GuCBL7）和4個（Gu-CBL4、GuCBL8、GuCBL9、GuCBL10）成員（圖 2）。

表2 烏拉爾甘草CBL基因家族特征分析Table 2 Characteristic analysis of G. uralensis CBL family genes

2.3 烏拉爾甘草GuCBL結構及保守基序分析

通過對內含子/外顯子結構和保守基序的分析，進一步研究烏拉爾甘草CBL的結構特征。結果顯示，不同組GuCBL成員顯示出不同的基因結構，總體上分為與系統(tǒng)進化分析一致的4個組A-D（圖3-a）。GuCBL包含12個保守基序（圖3-b）。所有的烏拉爾甘草GuCBL都含有motif 1-motif 5，分別是4個EF-hand結構域和PFPF結構域。

為了更直觀地體現(xiàn)GuCBL結構域的位置，對其進行了氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)它們除了在N端變化較大外，其他區(qū)域都相對比較保守。烏拉爾甘草GuCBL的氨基酸序列都含有4個EF手型結構（圖4）；此外，GuCBL5、GuCBL8和GuCBL9的N端都含有一個非常保守的豆蔻酞化位點。在EF4手型域后相差8個氨基酸左右的位置還存在PFPF結構域，該結構域中的絲氨酸殘基可能在提高CBL與CIPK之間互作的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。

2.4 烏拉爾甘草CBL基因在染色體上的定位及基因進化關系分析

染色體分布及基因復制結果顯示，GuCBL存在2個片段重復基因對GuCBL1/GuCBL7和GuCBL2/GuCBL3（圖1）。對烏拉爾甘草、擬南芥和大豆的CBL進行共線性分析，探究CBL基因家族的擴張情況，發(fā)現(xiàn)26對CBL基因間存在共線性關系（圖5）。為更深入地理解CBL基因在進化過程中的復制和功能分化，計算了GuCBL家族2個片段重復基因對的Ka/Ks值，GuCBL1/GuCBL7、GuCBL2/GuCBL3兩 組重復基因對的Ka/Ks＞1，說明它們進行了正向選擇（表3）。通過計算田島相對進化速率來評估這些重復對的進化速率，其P值小于0.05，表明GuCBL正在經(jīng)歷加速進化（表4）。

圖2 CBL家族的系統(tǒng)發(fā)育關系分析Fig. 2 Phylogenetic relationship analysis of the CBL family

2.5 烏拉爾甘草CBL基因順式作用元件分析

預測分析發(fā)現(xiàn)GuCBL上游1 500 bp啟動子序列中存多個逆境和激素應答元件（圖6），多個GuCBL成員啟動子具有TC-rich元件，說明這些成員可能與逆境應答相關。GuCBL3、GuCBL6和GuCBL10啟動子區(qū)域中有與生長素相關的響應元件TGA-元件、AuxRE ；GuCBL2、GuCBL3、GuCBL5、GuCBL6、GuCBL8和GuCBL10的啟動子含有GA響應的元件 TATC-box、P-box 和 GARE-motif；GuCBL1、GuCBL2、GuCBL4、GuCBL5、GuCBL6、GuCBL7 和GuCBL10的啟動子區(qū)域中檢測到ABA元件ABRE；除GuCBL3、GuCBL5、GuCBL7和GuCBL8外，其他GuCBL啟動子區(qū)域中均檢測到乙烯響應元件ERE；GuCBL1、GuCBL2、GuCBL4、GuCBL9和 GuCBL10 5個基因的啟動子順式作用元件中存在MeJA響應元件；4個 GuCBL的啟動子（GuCBL3、GuCBL5、GuCBL6和GuCBL7）還含有SA響應元件；表明GuCBL可能受到各種不同激素的調控。多個GuCBL啟動子中存在一個或兩個元件涉及類黃酮生物合成調控的MBSI元件，暗示這些GuCBL可能參與類黃酮的生物合成。以上結果表明，GuCBL可能與逆境應答、激素信號轉導和生長發(fā)育過程密切相關。

圖3 烏拉爾甘草CBL家族基因基因結構和保守基序分析Fig. 3 Conserved motif and gene structure analyses of CBL family genes in G. uralensis

2.6 烏拉爾甘草CBL基因的組織特異性表達分析

圖4 烏拉爾甘草 CBL的多序列比對和保守結構域分析Fig. 4 Multiple alignment and conserved motif analysis of CBL in G. uralensis

圖5 烏拉爾甘草、大豆和擬南芥CBL基因的共線性分析Fig. 5 Syntenic analysis of CBL genes in G. uralensis, G. max, and A. thaliana

表3 烏拉爾甘草同源CBL基因的Ka/Ks比值Table 3 Ka/Ks ratios for homologous CBL genes in G.uralensis

表4 烏拉爾甘草中同源CBL基因對的田島相對進化速率分析aTable 4 Tajima relative rate tests of homologous CBL gene pairs in G. uralensisa

提取烏拉爾甘草根、莖、葉的RNA并進行qRT-PCR，分析GuCBL的組織特異性表達特征。根據(jù)其表達情況經(jīng)MeV聚類分析后可分為4組（圖7），Ⅰ組和Ⅱ組的GuCBL成員在根組織中優(yōu)勢表達，同時在莖中有一定的表達，表明它們在根發(fā)育及相關生理代謝過程中可能發(fā)揮潛在的重要功能；Ⅲ組僅包含GuCBL6一個成員并在所有組織中表達均較低；Ⅳ組的2個成員GuCBL7和GuCBL10在莖中具有一定的表達，在根和葉中表達量都較低。以上結果表明，I組和II組的GuCBL可能在烏拉爾甘草根組織的發(fā)育及生理代謝過程中發(fā)揮著重要作用。

2.7 GuCBL響應非生物脅迫處理的表達特征分析

收集非生物脅迫處理的烏拉爾甘草根組織的材料并提取RNA進行qRT-PCR分析（圖8），GuCBL家族成員在不同的脅迫處理下的轉錄水平呈現(xiàn)不同的表達特征，通過MeV聚類后，GuCBL的表達分為不同的4個亞組。在NaCl刺激下，GuCBL的表達總體呈現(xiàn)下調表達，但N4組的3個成員GuCBL2、GuCBL9、GuCBL10在處理后6和12 h受到誘導表達。H2O2氧化脅迫處理后，O1組的基因家族成員呈上調表達，并在處理24 h后達到最大值；O2和O3組的成員GuCBL1和GuCBL7均呈現(xiàn)下調表達；H4組的3個成員GuCBL3、GuCBL4和GuCBL10在處理6 h后顯著上調隨后下降。PEG模擬干旱脅迫時，P1和P2組的GuCBL成員在處理6-24 h均表現(xiàn)出顯著的誘導表達。GuCBL基因家族在響應低溫、高溫刺激時，在一段時間內脅迫處理促進了基因的表達，4℃處理誘導了L2組的GuCBL1和GuCBL2、L3組的GuCBL9和GuCBL6的增加表達；42℃處理促進了H1組中4個成員和H3組中3個成員的顯著增加表達。結果表明，GuCBL可能通過增加表達在烏拉爾甘草響應逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

圖6 GuCBL啟動子中的順式作用元件分布Fig. 6 Distribution of cis-elements in GuCBL promoter regions

圖7 烏拉爾甘草GuCBL的組織特異性表達分析Fig. 7 Tissue-specific expression analysis of G. uralensis GuCBL genes

3 討論

細胞內Ca2+是調控多種細胞功能的第二信使［26］，植物受到非生物逆境與其他細胞外界刺激時會進行胞內外信號的轉化，鈣信使通過與鈣結合蛋白相互作用，將外界信息傳遞給不同的信號通路，進而調節(jié)細胞代謝活動，響應外界環(huán)境變化［27］。CBL作為一類重要的鈣離子結合蛋白，家族內不同的CBL成員的功能存在特異性，已從大豆、苜蓿、擬南芥等作物中均已克隆到多個CBL家族基因，為研究烏拉爾甘草CBL家族基因提供了一定基礎。

本研究從烏拉爾甘草基因組中鑒定獲得10個GuCBL基因。成員均含有能與鈣結合的EF-hand結構和與CIPK互作的PFPF結構域。烏拉爾甘草GuCBL可分為4個組，且存在多對垂直同源基因對。重復基因對的Ka / Ks比及田島相對進化速率，顯示GuCBL家族基因正處于加速進化過程中，其可能在基因家族的擴大過程中發(fā)揮著一定作用。啟動子順式作用元件分析顯示GuCBL成員不僅含有多個非生物脅迫響應元件，還存在許多激素響應、生長發(fā)育調控等元件，表明GuCBL潛在的重要功能。同一組內的GuCBL 基因含有脅迫及激素應答元件的類型和數(shù)量也各不相同，說明不同GuCBL的表達調控方式具有特異性和復雜性，其具體功能還需進一步研究。

CBL不僅參與種子萌發(fā)和幼苗生長過程，還參與植物自身的防御［28-29］。大多數(shù)烏拉爾甘草GuCBL基因在根組織中優(yōu)勢表達，暗示這些基因在植物根發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要功能。CBL在植物逆境應答信號中發(fā)揮極其重要的作用，該蛋白與其下游CIPK靶蛋白組成的CBL-CIPK信號系統(tǒng)參與了植物多種逆境應答信號途徑［30］。擬南芥AtCBL10主要受鹽誘導［31］；PbCBL9在鹽脅迫下、PbCBL2在低溫脅迫下持續(xù)高水平表達［32］；胡楊PeCBL6在干旱脅迫條件下呈震蕩變化的情況［33］。本研究對烏拉爾甘草進行了不同的脅迫處理，GuCBL在不同處理下呈現(xiàn)不同的誘導表達特征，暗示它們與逆境脅迫應答之間的密切關系。鑒于非生物脅迫能夠促進次生代謝產(chǎn)物的累積［34］，表明了GuCBL的表達與逆境脅迫下次生代謝產(chǎn)物合成之間的直接或間接聯(lián)系，具體的功能還需進一步的遺傳實驗驗證。

圖8 烏拉爾甘 GuCBL響應非生物脅迫的表達分析Fig. 8 Expression analysis of G. uralensis GuCBL genes in response to abiotic stress

4 結論

從烏拉爾甘草基因組中成功鑒定出10個GuCBL家族基因，GuCBL在根組織中較高表達，能夠被鹽、氧化、干旱、低溫和高溫誘導表達。