姜恩平，王 卓

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,廣東 東莞 523808；2.吉林市中心醫(yī)院,吉林 吉林 132001)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率和死亡率僅次于乳腺癌[1]。近年宮頸癌的發(fā)病逐漸增高并呈年輕化趨勢[2]。臨床上宮頸癌的治療主要采用手術(shù)和放化療方法，因臨床化療藥物的多藥耐藥及不良反應(yīng)，所以中藥以其有效低毒的優(yōu)勢已成為治療腫瘤的新途徑。莪術(shù)是中藥姜科植物蓬莪術(shù)、郁金以及廣西莪術(shù)的干燥根莖，具有行氣止血、止痛消炎等功效。 莪術(shù)二酮,又名姜黃二酮 、莪二酮，是莪術(shù)的主要有效成分之一，具有明顯抗血栓、抗感染鎮(zhèn)痛，神經(jīng)保護(hù)等作用[3]。近年研究表明，莪術(shù)二酮還具有抗腫瘤作用，對乳腺癌、肝癌、腎癌等具有一定的抑制作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長[4-5]，但是對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及凋亡和侵襲等方面還未見報(bào)道。本研究以Hela細(xì)胞株為研究模型，探討莪術(shù)二酮對宮頸癌的抑制作用，初步探討其抗腫瘤的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究莪術(shù)二酮抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品：本實(shí)驗(yàn)所用莪術(shù)二酮購自上海源葉生物科技有限公司；人Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和matrigel 基質(zhì)膠購自美國Gibco公司；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2儀器：倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，電熱恒溫水浴箱(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，Synger2酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)。以上試劑和儀器均按照說明書制備和使用。本次研究經(jīng)過我校醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)：Hela細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，放置于含5% CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代一次，取對數(shù)期細(xì)胞對其進(jìn)行增殖、凋亡和侵襲實(shí)驗(yàn)。Hela細(xì)胞分為對照組、莪術(shù)二酮低劑量組(12.5 μmol/L)、莪術(shù)二酮中劑量組(25 μmol/L)和莪術(shù)二酮高劑量組(50 μmol/L)等四組。細(xì)胞接種后24 h后加入不同濃度的莪術(shù)二酮繼續(xù)孵育細(xì)胞12～48 h，消化收集細(xì)胞測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2MTT法檢測細(xì)胞增殖的抑制實(shí)驗(yàn)：選取對數(shù)期的Hela細(xì)胞，進(jìn)行胰蛋白酶進(jìn)行消化、重懸，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組細(xì)胞為5復(fù)孔，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入10 μl MTT，培養(yǎng)結(jié)束后去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μl，搖床上振搖15 min，使藍(lán)紫色的結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長處測定其吸光度值。對照組細(xì)胞增殖抑制率為0%，其余各組細(xì)胞增殖抑制率=(對照組吸光值-各組吸光值/對照組吸光值)×100%。

1.3.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：經(jīng)上述處理的Hela細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用PBS溶液洗滌二次，置于離心機(jī)中以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，每份樣本收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，加入1 μl Annexin V-FITC混勻后加入5 μl Propidium Iodide混勻；室溫下反應(yīng)5 min，避光，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測?？偟蛲雎?早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3.4Transwell小室法檢測Hela細(xì)胞的侵襲能力：先將Matrigel用無血清的1 640培養(yǎng)基1∶5稀釋，取50 μl均勻鋪于小室上室，37 ℃靜置1 h，使其干成膠狀。將經(jīng)上述處理的Hela細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5 × 105個(gè)/ml，接種于Transwell板內(nèi)，上室加入含1%血清細(xì)胞懸液100 μl，下室加入含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl，每組3復(fù)孔，在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h取出小室，用棉簽擦去上室未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，PBS洗滌后,結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取平均值，并計(jì)算侵襲率。侵襲率=各給藥組細(xì)胞數(shù)/對照組細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1莪術(shù)二酮對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用：不同濃度的莪術(shù)二酮(12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)作用Hela細(xì)胞后，能夠明顯地抑制其增殖，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并具有時(shí)間和劑量依賴性關(guān)系，即隨著劑量濃度的增加和時(shí)間的延長其抑制率明顯升高。結(jié)果表明莪術(shù)二酮能夠抑制Hela細(xì)胞的增殖。見表1。

表1 不同濃度莪術(shù)二酮對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用(n=5)

2.2莪術(shù)二酮對Hela細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用：不同濃度的莪術(shù)二酮(12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)作用Hela細(xì)胞后48 h后，能夠明顯地誘導(dǎo)其凋亡，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并具有劑量依賴性關(guān)系，即隨著劑量的增加，凋亡率明顯升高。結(jié)果表明莪術(shù)二酮能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡。見表2。

表2 不同濃度莪術(shù)二酮對Hela細(xì)胞凋亡的作用(n=5)

2.3莪術(shù)二酮對Hela細(xì)胞侵襲能力的影響：與對照組比較，不同濃度的莪術(shù)二酮(12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)作用48 h后，Hela細(xì)胞穿過基底膜的數(shù)量隨著劑量的增加明顯減少，侵襲率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明莪術(shù)二酮能夠劑量依賴性抑制Hela細(xì)胞的侵襲。見表3。

表3 不同濃度莪術(shù)二酮對Hela細(xì)胞侵襲的影響(n=3)

3 討論

正常情況下細(xì)胞的增殖和凋亡維持一種動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡失調(diào)，則可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞凋亡是由多種因素參與的復(fù)雜的生理過程，涉及基因調(diào)控、信號傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答等方面。腫瘤是細(xì)胞增殖過度，凋亡受抑制使存活細(xì)胞多于死亡細(xì)胞所致的一類疾病。細(xì)胞在發(fā)生凋亡的過程中出現(xiàn)程序紊亂將會(huì)對腫瘤的形成起到促進(jìn)作用，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可以作為治療腫瘤的一個(gè)靶點(diǎn)。除了凋亡受到抑制，侵襲和轉(zhuǎn)移也是惡性腫瘤的主要特征之一。腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程復(fù)雜，涉及很多基因和信號分子的調(diào)控，如腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移基因、腫瘤內(nèi)和周圍新血管的形成、細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞黏附、腫瘤微環(huán)境等因素影響，如果這些環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，部分腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫離，侵襲穿越基底膜并向周圍組織浸潤生長，或是突破血管壁進(jìn)入到血管內(nèi)形成瘤栓，隨著血流運(yùn)行，到達(dá)靶器官并與該部位血管的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附，穿越管壁進(jìn)入轉(zhuǎn)移組織，完成腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。如果能夠抑制或干擾腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的某些環(huán)節(jié)，將會(huì)對腫瘤的治療起到積極的作用。中藥近年在抗腫瘤方面取得了顯著效果，中藥可以通過多種途徑來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和侵襲。研究表明中藥對于腫瘤的治療有其獨(dú)特的優(yōu)勢，許多中藥的有效成分能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7-8]。

莪術(shù)二酮是從中藥莪術(shù)中提取的揮發(fā)油的主要有效成分之一，近年研究表明莪術(shù)二酮除了抗感染、鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集等作用外，還具有抗腫瘤作用，對胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，莪術(shù)二酮能夠明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖，隨著劑量和時(shí)間的增加其抑制率逐漸增高；Annexin V-FITC凋亡結(jié)果顯示莪術(shù)二酮能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡；Transwell侵襲結(jié)果顯示，莪術(shù)二酮能夠劑量依賴性地抑制Hela細(xì)胞的侵襲。以上這些結(jié)果表明莪術(shù)二酮能夠抑制宮頸癌Hela增殖和侵襲，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究初步證實(shí)了莪術(shù)二酮抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲移的能力，此外其還具有較好的誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用,但具體機(jī)制與信號通路需進(jìn)一步研究，莪術(shù)二酮在預(yù)防和治療宮頸癌癌方面具有良好的應(yīng)用前景。