趙衛(wèi)平，李 嬋，洪 金，林鵬飛,*，雷穎虎,*

(1.秦嶺大熊貓研究中心，陜西 周至 710402；2.西北農(nóng)林科技大學(xué))

大熊貓是我國特有珍稀動物，冠有國寶美稱，盡管被劃分為國家一級保護(hù)動物，其數(shù)量卻仍然增長緩慢。除了人為因素的影響，這還與其獨(dú)特的生理繁殖機(jī)制有關(guān)，大熊貓是單季節(jié)發(fā)情動物，發(fā)情時間短，僅有1～3 d，如何精準(zhǔn)判斷大熊貓的發(fā)情期是提升大熊貓繁殖率的最關(guān)鍵一步。孕酮(Progesterone，P4)和雌激素(Estrogen)做為雌性動物發(fā)情時變化最為劇烈的兩種激素，且在動物尿液中就可檢測到，因此可作為大熊貓無侵入損害的一個檢測指標(biāo)。

目前ELISA檢測技術(shù)已大量應(yīng)用于激素檢測，HRP是ELISA試劑盒顯色體系的主要成分之一，其與抗原或者抗體結(jié)合可以形成酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體從而應(yīng)用于ELISA試劑盒中。P4為半抗原，化學(xué)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，不能與HRP直接結(jié)合，需要用11α-OH-P4進(jìn)行化學(xué)修飾后與HRP結(jié)合，因此本試驗旨在合成用于孕酮檢測的ELISA試劑盒的辣根過氧化物酶酶標(biāo)的P4-HRP偶聯(lián)物，為后續(xù)開發(fā)大熊貓孕酮ELISA檢測試劑盒提供所需的酶標(biāo)抗原。

1 材料與方法

表1 試劑及耗材

1.2 主要儀器

表2 試驗用儀器

1.3 方法

1.3.1 孕酮-半琥珀酸酯的合成 ①稱取5 g 11α-羥基孕酮(11α-OH-P

4)、5.96 g 琥珀酸酐與2.6 g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)于圓底燒瓶中，加入200 mL二氯甲烷，攪拌回流反應(yīng)5 ～10 h；②薄層色譜反應(yīng)(Thin layer chromatography，TLC)同時進(jìn)行跟蹤反應(yīng)進(jìn)度，展開劑為V乙酸乙酯：V石油醚=10∶1；③待反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液用60 mL二氯甲烷稀釋；④純化：反應(yīng)液用10 mL去離子水萃取1次，10 mL 2 M 鹽酸萃取2次，最后用去離子水萃取2次；⑤干燥脫色：加入無水硫酸鈉干燥，活性炭室溫攪拌脫色，過濾得無色澄明液，減壓蒸盡二氯甲烷，干燥得到白色結(jié)晶產(chǎn)物，即為11α-羥基半琥珀酸酯(11α-OH-P4-HS)。

1.3.2 11α-OH-P4-HS的鑒定 (1)11α-OH-P4-HS的TLC鑒定反應(yīng)至終點(diǎn)時，取少量反應(yīng)液，進(jìn)行TLC鑒定；(2)11α-OH-P4-HS的產(chǎn)率鑒定產(chǎn)率即合成反應(yīng)中實際產(chǎn)物的量與理論值的比值。在此合成反應(yīng)中，反應(yīng)物 11α-OH-P4的物質(zhì)的量與合成11α-OH-P4-HS的物質(zhì)的量的比值根據(jù)公式①計算：

產(chǎn)率= n(11α-OH-P4)/ n(11α-OH-P4-HS)× 100%

(公式①)

1.3.3 孕酮酶標(biāo)抗原的制備 ①取11α-OH-P4-HS 2.6 mg，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)0.9 mg和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)1.3 mg置于5 mL三角燒杯中，滴加0.15 mL二甲基甲酰胺(DMF)，混勻后4 ℃過夜；②次日發(fā)現(xiàn)有尿素衍生物結(jié)晶析出，說明已有孕酮衍生物的NHS活化酯形成；③取HRP 2 mg，用2 mL 0.1 M NaHCO3溶解，室溫下加活化酯2 μL攪拌，每10秒加2 μL，共10 μL。繼續(xù)攪拌8 h，用0.04 M pH 7.2的PBS 1 000 mL攪拌透析24 h，期間換液三次。

1.3.4 酶標(biāo)抗原的鑒定 (1)免疫學(xué)鑒定①包被：5 ng/mL 的P4單克隆抗體加入酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃過夜，倒出孔內(nèi)液體，洗滌液洗3次，拍干；②封閉：每孔加封閉液200 μL，37 ℃ 2 h，棄封閉液，洗滌液洗3次，拍干；③抗原反應(yīng)：11α-OH-P4、HRP以及產(chǎn)物，倍比稀釋為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800和1∶1 600，每孔100 μL，37 ℃ 60 min，棄反應(yīng)液，洗滌液洗3次，拍干；④顯色：每孔加新鮮配制的底物溶液100 μL，顯色10～15 min；⑤終止：每孔加終止液50 μL；⑥讀數(shù)：在450 nm處測定光密度(OD)值。(2)紫外掃描鑒定將一定濃度的半抗原、載體蛋白以及偶聯(lián)產(chǎn)物利用紫外分光光度計在200 nm-400 nm處進(jìn)行掃描，通過掃描波長的變化，判斷偶聯(lián)是否成功。(3)酶標(biāo)記率采用超微量紫外分光光度計，讀取酶標(biāo)復(fù)合物的 OD260 nm 值、OD280 nm值以及 OD403 nm值，根據(jù)公式分別計算酶標(biāo)復(fù)合物中的酶結(jié)合量與抗原含量，計算其酶標(biāo)記率。

酶結(jié)合量=OD403nm×0.42 (公式②)

抗原含量=(OD280nm-OD403nm×0.42) ×0.94×0.62 (公式③)酶標(biāo)記率=P4-HRP中的酶量(mg) /加入的HRP酶量(mg)×100%(公式④)

2 結(jié)果

2.1 孕酮-半琥伯酸酯的鑒定

2.1.1 孕酮-半琥珀酸酯的 TLC 鑒定 由于11α-OH-P4和11α-OH-P4-HS分子結(jié)構(gòu)的差異，二者極性也存在差異。本研究中，11α-OH-P4-HS在展開劑中的吸附性較強(qiáng)，而11α-OH-P4的吸附性較弱，因此，移動距離大的點(diǎn)為11α-OH-P4與副反應(yīng)產(chǎn)物，移動距離小的點(diǎn)為11α-OH-P4-HS，鑒定結(jié)果如圖1所示，該反應(yīng)已完全。

圖1 薄層色譜鑒定

2.1.2 孕酮-半琥珀酸酯的合成產(chǎn)率 根據(jù)公式①計算可得，11α-OH-P4-HS的產(chǎn)率為78.64%。

2.2 酶標(biāo)抗原的鑒定

2.2.1 酶標(biāo)抗原紫外掃描鑒定 紫外掃描鑒定見圖2，P4-HS、HRP以及產(chǎn)物三者的紫外掃描圖差異較大，產(chǎn)物紫外掃描于HRP、P4-HS均有不同。反應(yīng)中小分子物質(zhì)經(jīng)透析已去除，因此推測產(chǎn)物為HRP偶聯(lián)物。

圖2 紫外掃描鑒定結(jié)果

2.2.2 免疫學(xué)鑒定 免疫學(xué)鑒定如圖3所示，產(chǎn)物隨稀釋倍數(shù)增大，其OD值減小，HRP和P4-HS的OD值基本不隨濃度變化而改變。結(jié)果表明，產(chǎn)物與P4單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，而HRP、P4-HS不會與之發(fā)生反應(yīng)，即產(chǎn)物對P4單克隆抗體具有免疫學(xué)特性，HRP、P4-HS對P4單克隆抗體不具有免疫學(xué)特性。結(jié)合圖3結(jié)果，產(chǎn)物為HRP的偶聯(lián)物，HRP的偶聯(lián)物與P4單克隆抗體具有免疫學(xué)特性，則推測該偶聯(lián)物為P4-HRP。

圖3 免疫學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.3 酶標(biāo)記率 經(jīng)過超微量紫外分光光度計檢測酶標(biāo)復(fù)合物的 OD280nm 與 OD403nm 值，吸光度值分別為1.325、2.726，酶結(jié)合量1.145，其中抗原含量0.105，酶標(biāo)記率22.9%。

3 討論

11α-OH-P4官能團(tuán)為穩(wěn)定的羥基，不能直接與HRP結(jié)合，需要先將羥基通過DMAP催化，變?yōu)檩^為活潑的酯基，即11α-OH-P4-HS，再用偶聯(lián)了琥珀酸酐的11α-OH-P4-HS進(jìn)行試驗偶聯(lián)。羧基可以通過碳二亞胺與HRP中賴氨酸的氨基偶聯(lián)，形成酶標(biāo)抗原。

碳二亞胺法合成完全抗原時，HRP中賴氨酸數(shù)量對酶標(biāo)記率起決定作用。運(yùn)用碳二亞胺法合成偶聯(lián)物，碳二亞胺(DCC、EDC)為中間物，活化11α-OH-P4-HS的羧基，在NHS的催化下，與HRP上的賴氨酸中氨基形成酰胺鍵偶聯(lián)，因此一個HRP上可以偶聯(lián)多個11α-OH-P4-HS，綜上，在碳化二亞胺反應(yīng)中，11α-OH-P4-HS加入量應(yīng)略微過量。

在反應(yīng)中，過量的11α-OH-P4-HS以及碳二亞胺DCC、EDC和催化物NHS，均可能以不同的化學(xué)形態(tài)存在于終產(chǎn)物中，因此終產(chǎn)物中的很多副產(chǎn)物須進(jìn)行純化去除。常用的純化方法有透析和凝膠層析兩種，由于透析法較凝膠層析法簡單、易操作、可行性強(qiáng)，因此本研究選擇透析純化法。為取得較高保留率，本試驗選用8 000-14 000分子密度的透析袋，截留分子量值約為保留的大分子值的一半，且實驗中小分子值遠(yuǎn)小于最小保留量8 000；試驗中除偶聯(lián)物與載體蛋白外，其它都是小分子物質(zhì)，因此終產(chǎn)物僅有蛋白以及蛋白偶聯(lián)物。

本試驗?zāi)康氖侵苽溆糜贓LISA試劑盒的P4-HRP，因此在鑒定制備是否成功時，首先選擇免疫學(xué)檢驗，通過倍比稀釋P4-HRP，使其與相應(yīng)抗體反應(yīng)，同時用11α-OH-P4和HRP做對照，檢測P4-HRP與P4抗體反應(yīng)靈敏度。理論上11α-OH-P4與對應(yīng)應(yīng)一抗也存在特異性反應(yīng)，但本試驗中不明顯或不存在，可能因為11α-OH-P4是小分子物質(zhì)，在封閉過程中，其抗原表位可能被封閉液掩埋，因此特異性反應(yīng)不明顯。通過11α-OH-P4、HRP以及P4-HRP三者不同的紫外掃描曲線與峰值，鑒定抗原制備成功與否是本試驗的關(guān)鍵。碳二亞胺法合成P4-HRP的過程緩慢而復(fù)雜，存在很多終產(chǎn)物，即使經(jīng)過透析純化，也可能存在載體蛋白及載體蛋白復(fù)合物，這些復(fù)合物的紫外掃描曲線與反應(yīng)物的也不同。因此紫外掃描法不能完全判定偶聯(lián)是否成功，還需結(jié)合免疫學(xué)檢驗進(jìn)行鑒定。