席蘇望，周明芳，成 笛，陳開豐，萬 磊，熊 婷，劉秋紅，陳 彪，劉三鳳，毛輝榮*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045；2.江西省贛州市畜牧研究所，江西贛州 360702；3.江西省崇義縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西崇義 341300）

【研究意義】雞的羽色雖不是與優(yōu)質(zhì)直接相關(guān)的重要經(jīng)濟(jì)性狀，但羽色作為一個品種的獨特外觀，會直接影響消費者對活禽的挑選，因此一直是國內(nèi)優(yōu)質(zhì)雞選育的重要性狀之一，備受遺傳和育種學(xué)家所關(guān)注。開展基于中國地方雞羽色性狀的遺傳解析將極大豐富家雞羽色形成的分子機(jī)理，同時為地方雞的外觀選育提供有效的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鳥類羽色根據(jù)其形成模式主要分為兩類:一類是基于體內(nèi)黑色素模式的稱為色素色；另一類是基于外源類胡蘿卜素的攝入并在體內(nèi)沉積，與羽毛的微結(jié)構(gòu)有關(guān)，被稱作結(jié)構(gòu)色，后者一般利用物理結(jié)構(gòu)通過對光線的折射和干涉作用而產(chǎn)生變幻的色彩，可以令鳥類羽毛具有金屬光澤。目前所有已鑒別的影響羽色表型的基因均是基于黑色素模式的著色，同時這類羽色表型受遺傳因素的影響較大，具有顯著的可遺傳性[1]。雞的羽色變異非常豐富，但目前已發(fā)現(xiàn)的羽色功能基因卻很有限。根據(jù)最新OMIA（online mendelian inheritance in animals）在線數(shù)據(jù)庫（https:∕∕omia.org∕home∕）顯示，已有11個雞羽色因果功能基因位點被鑒別，其中影響黑羽的黑素皮質(zhì)激素受體1基因（Melanocortin 1 Receptors，MC1R）備受關(guān)注。

MC1R基因決定羽色擴(kuò)展基因座E（Extension，E），E位點包含8個等位基因，各等位基因?qū)?yīng)不同的羽色，黑色素沉著按照顯隱性關(guān)系排列次序為:E＞ER＞EWH＞E+＞Eb＞Es＞Ebc＞Ey。雞的MC1R基因位于11號染色體上，無內(nèi)含子，主要編碼G蛋白偶聯(lián)受體。研究發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)于黑素細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)調(diào)控黑色素生成的質(zhì)量與數(shù)量，促進(jìn)真黑素形成[2-3]。此外，MC1R基因是控制真黑素和褐黑素形成的開關(guān)，通過調(diào)控酪氨酸酶的活性影響真黑素和褐黑素的生產(chǎn)和分布，進(jìn)而影響禽類羽色形成[4-6]。2003年，Kerje等[5]利用紅色原雞和白來航雞雜交資源群體研究發(fā)現(xiàn)MC1R基因是控制雞羽色的重要編碼基因（E基因座），并推測MC1R基因E92K突變最可能是導(dǎo)致雞黑羽的因果突變。Kabir等[7]進(jìn)行了38種雞種MC1R基因單倍型與羽色的關(guān)聯(lián)性研究，發(fā)現(xiàn)雞羽色的形成與MC1R基因多態(tài)性密切相關(guān)。Ling等[6]對不同羽色雞種的MC1R基因序列比較結(jié)果表明，MC1R基因的E92K突變與雞的黑羽有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)c.637T＞C位點可能導(dǎo)致cAMP信號不響應(yīng)α-MSH而使個體不呈現(xiàn)黑羽表型。2014年，Dávila等[8]在對13個西班牙雞種MC1R基因檢測后發(fā)現(xiàn)c.274G＞A突變導(dǎo)致MC1R受體激活，進(jìn)而促進(jìn)真黑素生產(chǎn)并最終形成黑羽；同時發(fā)現(xiàn)c.637C＞T突變可能是導(dǎo)致真黑素生產(chǎn)功能喪失或下降的因果突變。Guo等[9]發(fā)現(xiàn)MC1R基因c.274G＞A促進(jìn)真黑素沉積，c.637T＞C導(dǎo)致無cAMP信號響應(yīng)α-MSH，從而減少真黑素沉積；Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)c.212T＞C和c.274G＞A和c.644A＞C 3位點同時存在于中國地方黑雞群體的每個個體，該研究小組于2020年再次認(rèn)定上述3個位點作為中國地方雞黑羽的遺傳標(biāo)記[11]。2020年，Kabir等[7]研究30種日本地方雞種MC1R基因單倍型與羽色的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明c.427A＞G和c.274G＞A突變分別有助于黃褐色羽和黑羽的形成；推測c.644A＞C突變可能通過抑制c.274G＞A的作用下使其純合位點導(dǎo)致雞羽色呈現(xiàn)似小麥色。

江西地處中國的中部地區(qū)，自然資源豐富，地方雞種資源尤為突出，目前已通過畜禽遺傳資源鑒定并收錄于《中國畜禽遺傳資源志:家禽志》的品種主要有9個，分別是東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、余干烏骨雞、南城五黑雞、安義瓦灰雞、崇仁麻雞、泰和絲羽烏骨雞、廣豐白耳黃雞、康樂黃雞和寧都黃雞[12]，此外，修水黃羽烏雞作為新發(fā)現(xiàn)的待鑒定遺傳資源也已收錄于《江西畜禽遺傳資源志》[13]。江西地方雞種不僅數(shù)量多，且種質(zhì)特性獨特，在羽色表型方面尤為豐富，包括5個類型:黑羽雞（東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、余干烏骨雞和南城五黑雞）、灰羽雞（安義瓦灰雞）、麻羽雞（崇仁麻雞），白羽雞（泰和絲羽烏骨雞）及黃羽雞（廣豐白耳黃雞、康樂黃雞、寧都黃雞和修水黃羽烏雞）[13]。

【本研究切入點】地方特優(yōu)質(zhì)肉禽的羽色直接影響消費者在活禽市場的挑選，進(jìn)而影響優(yōu)質(zhì)禽的銷售，因此家禽羽色不僅是一種品種的重要外觀特征，同時還具有重要的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。江西擁有多達(dá)10個地方雞種群體，且羽色類型豐富，但到目前為止，關(guān)于江西地方雞種羽色遺傳機(jī)制的全面和系統(tǒng)的研究鮮見報道，基于此，本研究以10個江西地方雞種（東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、余干烏骨雞、南城五黑雞、安義瓦灰雞、崇仁麻雞、泰和絲羽烏骨雞、廣豐白耳黃雞、康樂黃雞、寧都黃雞和修水黃羽烏雞）為研究對象，采用PCR產(chǎn)物直接測序法和單倍型法探究MC1R基因在江西地方雞種中的變異類型、單倍型分布及其對羽色的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗旨在鑒別MC1R基因在江西10個地方雞群體中的變異、單倍型分布及其頻率分布；進(jìn)一步探究MC1R基因各變異和單倍型對江西地方雞羽色表型形成的影響，尤其是黑羽表型的形成。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以10個江西地方雞種群體為研究對象，涉及的實驗雞品種、樣本數(shù)和羽色表型詳見表1。所有實驗動物樣本均來自原種場的核心群體。采集每只受試雞個體的翅靜脈血1 mL并用2%EDTA抗凝劑處理，存放于-20 ℃冰箱備用。

表1 實驗動物的品種、采樣數(shù)及羽色表型Tab.1 Breeds，sample number and feather color phenotype of experimental animals

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與質(zhì)量檢測 采用常規(guī)酚仿法[14]提取雞血液基因組DNA，使DNA溶于TE緩沖液，使用Nano Drop 2000微量紫外分光光度計（賽默飛，美國）檢測基因組DNA濃度和純度，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。然后將質(zhì)量合格的基因組DNA稀釋至20 ng∕μL的工作液，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI收錄的紅原雞MC1R基因序列（GeneBank登錄號為AB201629），通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列為MF 5′-GCTTTGTAGGTGCTGCAGTT-3′和MR 5′-TC‐CACCCATCTGTTTGTCCA-3′，擴(kuò)增片段長度為1 105 bp，引物于北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與測序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μL，分別包含1.1×T3 Super PCR Mix 12.5μL，MF 1μL，MR 1μL，DNA模板2μL，和ddH2O 8.5μL。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min；隨后進(jìn)行34個循環(huán)，1次循環(huán)為94 ℃變性50 s，59 ℃退火45 s和72 ℃延伸1min；72 ℃延伸13 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，均獲得特異性目標(biāo)條帶，部分凝膠成像圖片見圖1，PCR產(chǎn)物的純化和雙向測序均由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司完成。

1.2.4 序列比對和變異位點鑒別 測序結(jié)果利用SeqMan（DNASTAR 7.1）軟件進(jìn)行DNA序列比對和分析，檢測MC1R基因的變異位點并對各個樣本進(jìn)行基因型判定。

1.2.5 單倍型分析 基于各個實驗雞個體的基因型數(shù)據(jù)采用PHASE v2.1軟件[15]推斷獲得實驗雞群體的單倍型。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 利用EXCEL 2019軟件統(tǒng)計MC1R基因各變異位點在試驗品種群體中的基因型頻率、單倍型頻率，并根據(jù)基因型和單倍型在不同羽色地方雞群體中分布情況，分析其與羽色表型的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增與測序

雞MC1R基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

2.2 MC1R基因的突變位點及其在江西地方雞種中的分布頻率

利用SeqMan軟件對測序序列進(jìn)行比對，共檢測到15個突變位點（表2），其中錯義突變10個，分別為c.212T＞C（p.71Met＞Thr）、c.274G＞A（p.92Glu＞Lys）、c.334C＞T（p.112Arg＞Cys）、c.366C＞G（p.122Ile＞Met）、c.376G＞A（p.126Val＞Ile）、c.398T＞C（p.133Leu＞Pro）、c.409G＞A（p.137Ala＞Thr）、c.427A＞G（p.143Thr＞Ala）、c.637T＞C（p.213Cys＞Arg）和c.644A＞C（p.215His＞Pro），同義突變4個，分別為c.69C＞T、c.486C＞T、c.552C＞T、c.636G＞A和1個缺失突變（c.547_549delAAC（p.183delAsn））；其中c.366C＞G和c.547_549delAAC系新發(fā)現(xiàn)的突變位點。由表2可發(fā)現(xiàn)，新鑒別的c.366C＞G只在白羽群體中出現(xiàn)，3-bp缺失突變（c.547_549delAAC）僅在極少數(shù)黃羽個體中出現(xiàn)。

圖1 MC1R基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification products of MC1R gene

位點c.212T＞C（p.71Met＞Thr）和c.274G＞A（p.92Glu＞Lys）是黑羽群體（東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、余干烏骨雞和南城五黑雞）、灰羽群體（安義瓦灰雞）和麻羽群體（崇仁麻雞）中的共有錯義突變類型，同時3個羽色的群體在c.212T＞C位點上未檢測到TT型個體，在c.274G＞A位點上未檢測到GG型個體；在此基礎(chǔ)上，黑羽群體在c.637T＞C（T為有利等位基因）位點上和安義瓦灰雞存在差異，后者還存在一定比例的C等位基因；此外，與麻羽群體（崇仁麻雞）相比，黑羽群體在c.644A＞C（p.215His＞Pro）位點上以A等位基因為有利等位基因，未檢測到CC純合型個體。黃羽群體在MC1R基因中的檢測到的變異位位點數(shù)最多（表2）；而白羽群體（泰和絲羽烏雞）多個多態(tài)性位點（69、212、398、636、637和644）的主要基因型與黑羽群體不一致。

表2 各品種MC1R基因的變異位點基因型頻率Tab.2 The genotype frequency of variation in MC1R in each tested breed

續(xù)表2 Continued table 2

表3 基于17個SNPs的MC1R基因單倍型及氨基酸替換Tab.3 MC1R haplotypes based on the 17 SNPs and amino acid substitutions

續(xù)表3 Continued table 3

2.3 MC1R基因的單倍型構(gòu)建及其在江西地方雞種中的分布頻率

依據(jù)MC1R基因編碼區(qū)的15個變異位點共構(gòu)建了31種單倍型（H0-H30），其中H11，H14，H15，H16，H17和H27均為新發(fā)現(xiàn)單倍型，尚未見報道。本研究所構(gòu)建的各MC1R基因單倍型的構(gòu)成信息和在江西地方雞種中的分布頻率詳見表3。據(jù)研究表明H0、H10、H20、H21和H28單倍型為雞的野生型個體所具有[5,9,16]，H1-H30單倍型均是基于H0單倍型而確定。由表3可知，其中H1、H10、H27、H28和H30均只含有1個變異位點，依次分別是c.212T＞C、c.69C＞T、c.274A＞G、c.637T＞C和c.644A＞C變異位點。H2比H1多存在c.274G＞A變異位點。H2～H7的共同特征是2個錯義突變位點（c.212T＞C和c.274G＞A）。其中，相比于H2，H3和H4分別還存在c.644A＞C變異位點和c.69C＞T變異位點。且基于H4單倍型，H5進(jìn)一步擁有c.636G＞A和c.637T＞C變異位點，H6也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了c.637T＞C和c.644A＞C變異位點；H7比H6少擁有c.637T＞C變異位點。H8和H9都由c.69C＞T和c.644A＞C變異位點組成，兩者區(qū)別在于H8多擁有c.636G＞A變異位點。H11是由1個新發(fā)現(xiàn)的缺失突變位點（c.547_549delAAC）和2個已發(fā)現(xiàn)的同義突變位點（c.69C＞T和c.486C＞T）組成的。H12比H10多表現(xiàn)1個錯義突變位點（c.274G＞A），但H13比H12還多存在c.409G＞A變異位點。H14～H18共享已報道的c.274G＞A、c.636G＞A和c.637T＞C變異位點，其中，除共享變異位點外，H15只擁有c.398T＞C變異位點；與H15的區(qū)別在于H14、H16和H18均多擁有1個變異位點（依次是c.69C＞T、c.366C＞G和c.376G＞A），而H17是多存在2個錯義突變位點（c.366C＞G和c.376G＞A）。H19～H25均發(fā)現(xiàn)c.636G＞A和c.637T＞C變異位點，其中H19、H21和H25分別比H20多c.398T＞C、c.552C＞T和c.427A＞G變異位點；于H21的基礎(chǔ)上，H22和H23還共同擁有c.3334C＞T和c.552C＞T變異位點，而二者差異在于H23還發(fā)現(xiàn)了c.69C＞T變異位點；且H24比H25也僅多擁有c.69C＞T變異位點。H26比H25少發(fā)現(xiàn)c.636G＞A變異位點。H29表現(xiàn)2個錯義突變位點，分別是c.637T＞C和c.644A＞C變異位點。

MC1R基因單倍型在333羽江西地方雞中的分布和單倍型頻率詳見表4。由表4可知，黑羽群體的優(yōu)勢單倍型為H2和H4，其中東鄉(xiāng)綠殼蛋雞群體只發(fā)現(xiàn)1種單倍型H4，南城五黑雞群體中發(fā)現(xiàn)每個個體均存在H4，余干烏骨雞每個個體均含有H2或H4?；矣鹑后w（安義瓦灰雞）的優(yōu)勢單倍型是H4和H5，每個個體都含有H4或H5單倍型。在崇仁麻雞中，H7為優(yōu)勢單倍型，每個個體均含有H7單倍型。結(jié)合表3可知，H2、H4、H5和H7 4種單倍型中均含有共同的c.212T＞C和c.274G＞A 2個錯義突變位點，相較于H2單倍型，H4增加了c.69C＞T位點，而H5又比H4增加了c.636G＞A和c.637T＞C變異位點，H7比H4增加了c.644A＞C變異位點。白羽群體的主要單倍型是H7和H15，其中泰和絲羽烏骨雞群體發(fā)現(xiàn)較多單倍型，除2個主要單倍型外，其他單倍型均出現(xiàn)頻率較低。此外，黃羽群體中的單倍型數(shù)量最多，多態(tài)性最豐富，優(yōu)勢單倍型主要是H0、H7、H24和H25；其中修水黃羽烏雞群體的主要單倍型是H0、H7和H25，H24和H25單倍型在廣豐白耳黃雞群體屬高頻率單倍型，寧都黃雞群體中主要發(fā)現(xiàn)H25，康樂黃雞群體主要擁有H7和H25。

表4 各品種MC1R基因的單倍型頻率Tab.4 Thehaplotypes frequency of MC1R in each tested breed

3 討論與結(jié)論

本研究通過PCR產(chǎn)物直接測序法在333羽江西地方雞中共發(fā)現(xiàn)MC1R基因突變15個，其中2個突變（c.366C＞G（p.122Ile＞Met）和c.547_549delAAC（p.183delAsn））系新發(fā)現(xiàn)，基于上述變異位點，共構(gòu)建單倍型31條（H0-H30），其中新發(fā)現(xiàn)的單倍型有6條（H11、H14、H15、H16、H17和H27），MC1R基因眾多的變異位點和單倍型被鑒定間接表明江西地方雞種羽色豐富，內(nèi)在遺傳多樣性較好。而本研究在東鄉(xiāng)綠殼蛋雞群體中僅構(gòu)建了1種單倍型H4，一定程度上說明東鄉(xiāng)綠殼蛋雞的品種純度高，這與本實驗室前期通過芯片技術(shù)分析7個江西地方雞種遺傳多樣性和血緣組成的結(jié)果一致[18]。

本研究中東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、余干烏骨雞和南城五黑雞均為純黑羽的個體，他們均共享有2個錯義突變（c.212T＞C（p.71Met＞Thr）和c.274G＞A（p.92Glu＞Lys））（表2），表明上述2個位點與江西地方雞純黑羽的羽色形成有關(guān)。這與Kerje等[5]通過雜交實驗分析發(fā)現(xiàn)c.274G＞A是西方雞種純黑羽表型形成的因果突變并不完全一致；諸多報道也表明c.274G＞A突變與家雞黑羽密切相關(guān)[7-9,17]，而Ling等[6]發(fā)現(xiàn)黑色素等位基因ER只含有c.274G＞A多態(tài)性位點，而其羽色表現(xiàn)為大部分黑羽，非純黑羽表型。單倍型構(gòu)建結(jié)果（表3）顯示同時含有上述2個錯義突變位點在內(nèi)的單倍型主要有6種（H2-H7）；單獨含有c.212T＞C位點在內(nèi)的單倍型為H1，而單獨含有c.274G＞A突變在內(nèi)的單倍型有7條（H12-H18）。

單倍型結(jié)果顯示江西地方黑羽個體均含有H2（c.212T＞C和c.274G＞A）或H4（c.69C＞T，c.212T＞C和c.274G＞A）單倍型，二者均共享有上述c.212T＞C和c.274G＞A 2個錯義突變位點，其中東鄉(xiāng)綠殼蛋雞已由H4固定，這與中國和日本兩國的地方黑羽雞群體的研究結(jié)果相一致[7,9-11]。相較之于東鄉(xiāng)綠殼蛋雞只有H4 1種單倍型，南城五黑雞和余干烏骨雞還分別具有其他單倍型，表明群體的遺傳多樣性更豐富。與H4單倍型組成相比，H3單倍型缺少了c.69C＞T位點，但同時增加了c.644A＞C（p.215His＞Pro）位點；H5單倍型組成增加了c.636G＞A和c.637T＞C（p.213Cys＞Arg）位點；H6單倍型增加了637和644位點；H7增加了637位點。崇仁麻雞的優(yōu)勢單倍型為H7且每個個體都具有H7單倍型，已有的研究表明H7單倍型中的c.644A＞C（p.215His＞Pro）位點是金鳳花（Buttercup）羽色雞的特定單倍型[5]，c.644A＞C變異位點多次被報道具有抑制c.274G＞A（或c.212T＞C）變異位點的黑色素沉積作用，進(jìn)而降低MC1R基因的活性與表達(dá)量，并促進(jìn)褐色素的形成，最終導(dǎo)致羽毛顏色不呈現(xiàn)黑色[5,7]，而本研究中所有的黑羽個體在c.644A＞C位點上均未檢測到CC突變型個體，由此可見，決定江西地方雞黑羽表型的位點除c.212T＞C和c.274G＞A 2個錯義突變外，還需關(guān)注c.644A＞C位點。

安義瓦灰雞是近年來江西省新鑒定的資源，因其具有稀有的“瓦灰”羽色表型而著稱[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，所有的瓦灰雞個體均含有H4或H5單倍型，以往報道發(fā)現(xiàn)c.637T＞C突變可能導(dǎo)致不產(chǎn)生cAMP信號響應(yīng)α-MSH并減少真黑素生產(chǎn)沉積，進(jìn)而出現(xiàn)稀釋黑色素羽色，比如“灰羽”[6,8-9,20]。但本研究中，H5單倍型出現(xiàn)在安義瓦灰雞群體頻率較低（0.163），僅能部分解釋安義瓦灰雞的灰羽是由黑羽稀釋而來，但不能完整解釋灰羽表型的形成，推測可能存在其他位點能夠起到稀釋黑色素的功效，具體位點有待更深入的研究解析。本研究中雖然在泰和絲羽烏骨雞中也檢測到黑羽突變位點c.212T＞C和c.274G＞A，但由于TYR基因4號內(nèi)含子上7.5 kb逆轉(zhuǎn)錄病毒序列插入造成的TYR酶喪失跨膜轉(zhuǎn)運的能力，使黑色素不能沉積于羽毛組織，從而呈現(xiàn)出隱性白羽的表型[21]。黃羽群體中部分個體檢測到H7單倍型，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因是部分黃羽個體在頸部帶有麻羽，同時部分個體尾羽中存在少量黑羽。

綜上所述，本研究通過對333羽江西地方雞種中MC1R基因的變異位點鑒定和單倍型構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)c.212T＞C和c.274G＞A 2個錯義突變共同作用導(dǎo)致中國地方雞黑羽形成；同時c.637T＞C與c.644A＞C變異位點能干擾抑制這一共同作用，前者能夠?qū)谏M(jìn)行稀釋從而呈現(xiàn)出安義瓦灰雞“灰羽”羽色；后者從而促進(jìn)褐黑素合成，并降低真黑素的合成量，導(dǎo)致羽毛呈現(xiàn)出麻羽等類型的羽色，同時可將c.212T＞C、c.274G＞A和c.644A＞C 3個位點作為中國地方雞黑羽分子鑒定的有效標(biāo)記。

致謝：感謝江西省各地方雞保種場對本研究中樣本的支持。