何唯唯，王晨鈺,2，楊捷威，徐 斌*，郭 磊*，謝劍煒

(1.軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2.中央民族大學(xué) 藥學(xué)院，民族醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

工業(yè)油料作物蓖麻(Ricinuscommunis，R.communis)具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，蓖麻植株在國際范圍內(nèi)，包括中國南北均廣泛分布[1]。誤用或蓄意使用蓖麻籽引發(fā)的中毒暴露事件屢有發(fā)生，另外，蓖麻毒素信件多次引發(fā)社會(huì)恐慌[2]。蓖麻籽中除富含蓖麻油酸(占總含油量的90%)外[3]，還含有糖、蓖麻油酸、蓖麻堿、蓖麻防御肽、蓖麻毒素(0.1%～0.5%)、蓖麻凝集素、儲(chǔ)存蛋白等多種物質(zhì)，其中蓖麻毒素為劇毒性生物毒素，對(duì)小鼠的半數(shù)致死劑量(LD50，靜脈注射)為5～10 μg/kg，對(duì)成人的半數(shù)致死劑量為1～20 mg/kg(口服)，成人口服8～12個(gè)蓖麻籽即可致死[4-8]。蓖麻凝集素亦存在較高毒性，但其毒性較蓖麻毒素低2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，純化的蓖麻毒素、蓖麻籽的毒素粗提物以及蓖麻籽等均為誤服、蓄意投毒等蓖麻中毒或威脅事件的潛在來源。

不同制備工藝、不同產(chǎn)地的蓖麻籽溯源等是蓖麻中毒相關(guān)事件剖析確證中的必要環(huán)節(jié)。除了劇毒性的蓖麻毒素、蓖麻凝集素之外，值得注意的是，蓖麻防御肽，又稱肽類生物標(biāo)志物(R.communisbiomarkers，RCB)，廣泛存在于不同品種的蓖麻籽中[8]，其序列與植物防御素高度相似，可能在種子萌發(fā)前的過程中發(fā)揮保護(hù)作用，抵御真菌和細(xì)菌等病原體的入侵[9]，與蓖麻籽的毒性機(jī)制存在一定相關(guān)性。

近年涌現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離-質(zhì)譜成像(Matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging，MALDI-MSI)技術(shù)，在組織學(xué)水平上將質(zhì)譜提供的分子結(jié)構(gòu)信息與成像技術(shù)提供的空間分布信息相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)組織切片中各種分子的無標(biāo)記、高靈敏、高通量檢測和定位，從而在分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中備受關(guān)注[10]。在植物生物學(xué)領(lǐng)域[11]，已出現(xiàn)應(yīng)用質(zhì)譜、串聯(lián)質(zhì)譜和MSI技術(shù)對(duì)植物組織中的肽類及蛋白質(zhì)等進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定、豐度測定、定位及分布等整合性分析研究。例如，針對(duì)3個(gè)品種桃子的果皮部分，闡述了變應(yīng)原Pru p3蛋白及其差異性分布[12]；在番茄種子中發(fā)現(xiàn)4種不同亞型的非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并揭示其定位信息[13]；在茄科植物中發(fā)現(xiàn)新型、不均勻分布的環(huán)肽等[14]。李靈軍課題組[15]基于MALDI-MSI方法，對(duì)苜蓿中的數(shù)百個(gè)內(nèi)源性肽及蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了從頭測序(Denovo)及可視化研究，揭示了不同發(fā)育階段的空間分布變化?？梢姡琈SI技術(shù)為植物生長和脅迫應(yīng)答過程中新類型肽類生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及潛在防御機(jī)制等研究提供了新的研究視角[16]。

對(duì)于不同品種、產(chǎn)地的蓖麻籽，其內(nèi)源性潛在生物標(biāo)志物的組織定位、空間分布以及產(chǎn)地之間的特征差異比較研究尚屬空白。本研究以3種RCB為靶向標(biāo)志物，首次利用其在種子內(nèi)高豐度存在、無明顯細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，在系統(tǒng)探討和優(yōu)化冷凍切片、基質(zhì)噴霧方法及各參數(shù)條件的基礎(chǔ)上，建立了蓖麻籽的二維(Two-dimension,2D)及三維(Three-dimension,3D)MALDI-MSI分析策略。該方法安全可靠，易于推廣。進(jìn)一步選擇中國兩大類典型種植環(huán)境代表產(chǎn)地—山西(華北地區(qū)，北緯34°～40°，東經(jīng)110°～114°)、四川(華南地區(qū)，北緯26°～34°，東經(jīng)97°～108°)來源，應(yīng)用于兩地蓖麻籽的RCB可視化研究(圖1)，初步揭示了MALDI-MSI方法在蓖麻籽產(chǎn)地溯源研究的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖1 蓖麻籽樣品制備、內(nèi)源防御肽的MALDI-MSI方法及數(shù)據(jù)分析策略示意圖(★為關(guān)鍵步驟)Fig.1 Schematic diagrams of sample preparation of castor beans,MALDI-MSI towards three defense peptides,and data processing,where pentagram represents the key point

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀(配備SmartbeamTM固態(tài)激光器，激光波長355 nm，采樣頻率200 Hz，含F(xiàn)lexControl、FlexAnalysis、FlexImaging、SCiLS Lab 2020a Premium 3D軟件)，ImagePrep聲波霧化自動(dòng)基質(zhì)噴霧儀、氧化銦錫(ITO)導(dǎo)電載玻片，均為德國Bruker Daltonik公司產(chǎn)品。CM 1950低溫冷凍切片機(jī)(德國 Leica公司)，Perfection V370高分辨切片掃描儀(日本EPSON公司)，Tecan M1000 PRO酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);ID 602空氣壓縮噴霧器、ID A2超聲微網(wǎng)噴霧器(北京氧精靈公司)。

α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA，99%)購自德國Bruker公司；羧甲基纖維素鈉(CMC，平均分子量25 000)為化學(xué)純，購自上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈、甲醇(質(zhì)譜純)購自德國Merck公司。冷凍包埋劑OCT由德國Leica公司提供；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Thermo Fisher公司；CCK-8增強(qiáng)型試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司(上海)。人宮頸癌HeLa模型細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)研究院抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，蓖麻籽購自山西、四川藥材市場。

1.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

HeLa細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別設(shè)置1～400 pmol/L的蓖麻毒素陽性對(duì)照組以及1 nmol/L～1 mmol/L的RCB 1～3和空白對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基與CCK-8試劑體積比為10∶1，孵育1 h后在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(測量值-空白組)/(對(duì)照組-空白組)×100%。

1.3 三種RCB的從頭測序及結(jié)構(gòu)模擬

對(duì)組織切片中的RCB進(jìn)行原位二級(jí)質(zhì)譜鑒定。將終濃度為0.1 mol/L的二硫蘇糖醇(DTT)加至7 g/L的HCCA基質(zhì)中，37 ℃孵育30 min后，在LIFT碎裂反射正模式下分別對(duì)RCB標(biāo)準(zhǔn)肽段和組織切片進(jìn)行原位RCB二級(jí)質(zhì)譜鑒定分析。數(shù)據(jù)通過Biotools軟件進(jìn)行de novo分析，并與Sequence Editor軟件構(gòu)建的參考序列進(jìn)行對(duì)比。RCB 1(PDB ID 2MTM)的結(jié)構(gòu)來自蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)，RCB 2和RCB 3通過與RCB 1比對(duì)，再通過Pymol分子可視化軟件模擬得出。

1.4 組織切片制備與基質(zhì)噴涂

將蓖麻籽剝?nèi)シN皮，沿冠狀面夾開，盡量保持種子的完整性。然后將去皮的蓖麻籽浸泡于4% CMC中，于4 ℃冰箱內(nèi)浸泡5日。使用時(shí)小心用鑷子夾出完整的半枚蓖麻籽(即其一片子葉)，用4% CMC包埋，調(diào)節(jié)切片厚度為20 μm，并在-20 ℃下切割。將切下的薄片迅速轉(zhuǎn)移至ITO涂覆的導(dǎo)電玻片表面，切片發(fā)生融化并在CMC黏性作用下固定于玻片。真空干燥10 min后備用。對(duì)于3D重構(gòu)，針對(duì)半枚種子，從外部種皮向內(nèi)制備矢狀面切片，每7個(gè)切片等間距選擇一片，構(gòu)成連續(xù)切片序列。

精密稱取適量的HCCA粉末并溶于50%的乙腈-水溶液中，配制成終質(zhì)量濃度為7 g/L的HCCA基質(zhì)溶液，體系內(nèi)另加0.2%(體積比)的三氟乙酸(TFA)。將配制好的HCCA基質(zhì)溶液均勻覆蓋在組織切片上。

1.5 MALDI-MSI分析

選擇正離子反射模式對(duì)組織切片樣品進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，設(shè)置檢測質(zhì)荷比范圍為m/z1 000～4 000。每個(gè)采樣點(diǎn)激光照射400次。掃描空間分辨率為50 μm。使用Flex Analysis 3.4及Flex Imaging 4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，再采用SCiLS Lab 2020a Premium 3D軟件進(jìn)行MSI圖像構(gòu)建，包括降噪、譜圖歸一化及質(zhì)譜峰獲取，繼而進(jìn)行相關(guān)性矩陣分析、主成分分析(Principle components analysis，PCA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種RCB的質(zhì)譜鑒定及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

植物防御素是植物種子中的一類多肽及小分子蛋白，通常分子量小于10 kDa，一級(jí)序列中存在多個(gè)半胱氨酸(Cysteine，Cys)殘基，且均以二硫鍵相連[9,17-19]。本文首先對(duì)蓖麻籽中3個(gè)RCB序列進(jìn)行從頭測序分析(圖2)，RCB 1～3分子量在2 kDa左右，均含有4個(gè)Cys殘基，序列上高度相似[8,20]。其中，RCB 1(含19個(gè)氨基酸)與RCB 2(18個(gè)氨基酸)序列同源性為94.7%(RCB 1多出19Ser)，RCB 2(18個(gè)氨基酸)與RCB 3(18個(gè)氨基酸)序列同源性為94.4%(RCB 3為7Leu，而RCB 2為7Met)。

圖2 3種RCB的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列[6](A)、三維結(jié)構(gòu)模擬(B，青色代表β-轉(zhuǎn)角，藍(lán)色代表二硫鍵)以及MALDI-MS/MS二級(jí)質(zhì)譜鑒定比對(duì)(C～E，C:RCB 1;D:RCB 2,E:RCB 3)Fig.2 The amino acid sequences[6](A),the simulated structures(B,where the cyan and blue lines mark the 3D structures of β-turns and the corresponding disulfide bonds,respectively),and the de novo sequencing in MALDI-MS/MS(C-E,C:RCB 1;D:RCB 2,E:RCB 3) of three RCBs

RCB 1的二級(jí)質(zhì)譜圖中很難得到m/z1 000～1 500間的碎片信息，結(jié)合Boldbaatar等[20]的前期研究，筆者認(rèn)為RCB 1具有穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其二硫鍵增強(qiáng)了其β-轉(zhuǎn)角附近的穩(wěn)定性，從而使其源內(nèi)裂解電離穩(wěn)定性增強(qiáng)。對(duì)于RCB 1～3，在DTT還原性條件下，C端Cys附近及N端1Ala附近的二級(jí)質(zhì)譜裂解效率略有提高。最終獲得了N端前6～7個(gè)殘基以及C端后4～5個(gè)殘基的陽性片段，可鑒定出3種RCB在種子中的存在。此外，發(fā)現(xiàn)序列中部10Pro-Pro-Phe-Ala難以碎裂，可能由β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)中脯氨酸殘基較穩(wěn)定所致。

同時(shí)，選擇常用真核細(xì)胞模型—HeLa細(xì)胞，以CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)獲取對(duì)3種RCB細(xì)胞毒性的認(rèn)識(shí)。結(jié)果表明，陽性對(duì)照—蓖麻毒素可顯著抑制HeLa細(xì)胞的生長，24 h后半數(shù)抑制濃度(IC50)約為20 pmol/L，而RCB 1～3則無明顯細(xì)胞毒性，IC50均>300 μmol/L。

2.2 蓖麻籽組織切片的制備

蓖麻籽的含油量高，組織質(zhì)軟，連續(xù)、完整的組織切片存在一定難度，需在制備前實(shí)施充分浸泡。另外，需要兼顧兩種不同產(chǎn)地來源的蓖麻籽的特性，即山西來源的種子顆粒稍大，質(zhì)硬且較完整；四川來源的種子顆粒較小，質(zhì)較軟、易碎。需選擇適宜的浸泡液和包埋劑。

筆者發(fā)現(xiàn)，常用組織包埋劑OCT在MALDI-MSI檢測的多肽質(zhì)荷比范圍(m/z1 000～4 000)內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量譜峰，嚴(yán)重干擾目標(biāo)肽類檢測。另外幾種MALDI-MSI常用的包埋劑—蔗糖、明膠、水和CMC中，CMC對(duì)m/z1 000～4 000 Da范圍內(nèi)基本無干擾，且自身可提供較高粘度，使得在切片制備過程中所造成的分析物位移可基本忽略，較適用于蓖麻籽切片包埋。CMC本身亦可提供合適的分子網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)可作為蓖麻籽的浸泡液，從而利于提高切片干燥后的強(qiáng)度[21]。但當(dāng)CMC濃度低于4%、浸泡4日或以下時(shí)限時(shí)，均無法獲得良好組織結(jié)構(gòu)的組織切片，最終選取4% CMC浸泡5日后獲得致密度適宜的種子。

組織切片厚度對(duì)結(jié)構(gòu)完整性及質(zhì)譜成像質(zhì)量存在關(guān)鍵影響。本文在10～30 μm范圍內(nèi)選擇了14、20、25、30 μm四個(gè)厚度的組織切片，進(jìn)行相同條件下的樣品制備和基質(zhì)噴霧。結(jié)果表明，最適宜的蓖麻組織切片厚度為20 μm。當(dāng)組織切片厚度小于20 μm時(shí)，切片上易產(chǎn)生較多空洞，難以保持結(jié)構(gòu)完整性，造成切片中RCB 1～3的損失，質(zhì)譜峰強(qiáng)度較低；而切片厚度大于20 μm時(shí)，組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，但靈敏度降低，其原因可能與樣品表面與導(dǎo)電靶板間的電阻過高，分析物的電離效率降低相關(guān)(如圖3A)。

2.3 基質(zhì)噴霧條件的優(yōu)化

2.3.1 基質(zhì)噴霧方式的選擇比較了3種霧化器—空氣壓縮噴霧器、超聲微網(wǎng)噴霧器和ImagePrep聲波霧化基質(zhì)噴涂儀的噴霧均勻性和基體消耗效率。結(jié)果表明，兩種低成本的市售醫(yī)用噴霧器(空氣壓縮噴霧器、超聲微網(wǎng)噴霧器)可形成較ImagePrep更為微小的噴霧液滴；但基質(zhì)晶體的均勻性及重復(fù)性要遜于ImagePrep(見表1、圖3B)。

圖3 組織切片厚度(A)及基質(zhì)噴霧方式(B)對(duì)3種RCB譜峰強(qiáng)度的影響Fig.3 Influence of the thickness of sections(A) and the matrix deposition modes(B) on mass spectrum intensities of three RCB

表1 3種基質(zhì)噴霧方式的效果比較Table 1 Comparison of the matrix deposition effects among three different spraying modes

2.3.2 基質(zhì)噴霧條件的優(yōu)化本文對(duì)ImagePrep基質(zhì)噴霧的3個(gè)主要參數(shù)，即基質(zhì)厚度(Matrix thickness)、孵育時(shí)長(Incubation time)及濕度(Wetness)進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化?；|(zhì)厚度體現(xiàn)為利用噴霧儀的光學(xué)傳感器監(jiān)測并轉(zhuǎn)換出的始末電壓差值，與消耗的基質(zhì)總量直接相關(guān)，影響組織切片表面的分析物的共晶及電離效率；孵育時(shí)長即在每次完整噴霧循環(huán)過程結(jié)束、停止氣流干燥后，基質(zhì)與切片共孵育的間隔時(shí)長，其對(duì)基質(zhì)與分析物形成共晶的影響顯著，但若孵育時(shí)長過長，會(huì)明顯增加整體噴霧時(shí)間；濕度為每次噴霧循環(huán)開始時(shí)，殘留于組織切片的濕度，亦稱為干燥強(qiáng)度。

進(jìn)行了三因素三水平L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，因素和水平分別為：基質(zhì)厚度(0.3、0.5、0.7 V)、孵育時(shí)間(10、30、50 s)、濕度(26.67%、40%、53.33%)。最終確定用于MALDI-MSI的最佳基質(zhì)噴霧參數(shù)組合為，基質(zhì)厚度0.5 V，孵育時(shí)間30 s，濕度53.33%。三個(gè)因素中，孵育時(shí)長對(duì)譜峰強(qiáng)度的影響最為顯著，基質(zhì)厚度其次，濕度影響則相對(duì)較低。

2.4 基于MALDI-MSI對(duì)不同產(chǎn)地蓖麻籽的檢測

2.4.1 山西、四川蓖麻籽中RCB的豐度及空間分布比較如圖4所示，山西來源和四川來源的蓖麻籽，在m/z1 000～4 000 范圍內(nèi)的譜峰分布和強(qiáng)度存在明顯差異。3種RCB所在的m/z1 900～2 100 區(qū)段，基本無其它多肽干擾，提示RCB獨(dú)特的生物標(biāo)志物價(jià)值。山西來源種子中的內(nèi)源肽在m/z1 900～2 600范圍內(nèi)豐度較高，包含了3種RCB；四川來源種子中的內(nèi)源肽在m/z1 100～1 300范圍內(nèi)則較為集中。山西來源種子中3種RCB的含量均多于四川來源。對(duì)于蓖麻籽的正中冠狀面，其MALDI-MSI的整體豐度分析表明，山西來源的蓖麻籽中RCB 3豐度最高，且RCB 3>RCB 2>RCB 1；而四川來源的蓖麻籽中RCB 2豐度最高，且RCB 2>RCB 3>RCB 1，兩種來源的RCB 1均含量最低。

圖4 山西、四川來源的蓖麻籽中RCB 1～3的質(zhì)譜強(qiáng)度(A～B,A：山西來源，B：四川來源)、空間分布(C)及相對(duì)豐度(D，紫色為山西，黃色為四川。四川來源的RCB豐度為×10后的結(jié)果)Fig.4 Overall MS peaks(A～B,A is Shanxi's,B is Sichuan's),the spatial distribution(C),and the relative contents of the three RCBs(D) in the castor beans from Shanxi's(yellow bars) and Sichuan's(purple bars) in the 2D MSI,in(D) the yellow bars were shown as a zoomed in view of Sichuan's data at 10-fold magnification

MALDI-MSI還可給出3種RCB更多的分布信息。這3種高度相似的多肽均分布于種子的內(nèi)層，主要為胚乳和胚芽部位，外部種皮部位則分布較少。

2.4.2 山西來源蓖麻籽中RCB分布及3D重構(gòu)本文將20片組織切片的2D MSI結(jié)果進(jìn)行3D重構(gòu)，進(jìn)一步比較了山西來源的2D及連續(xù)間隔切片的3D空間重構(gòu)結(jié)果。圖5結(jié)果顯示，3種RCB的分布均呈現(xiàn)以下整體性規(guī)律：切片1～3接近種子外種皮，切片面積較小，RCB在切片1～3中均存在分布；切片4～11位于種子胚乳處靠近胚芽的一端，面積略大于切片1～3，RCB相對(duì)豐度較低，主要分布于胚乳部分，而胚以外的部分較少；切片12～20的面積逐漸遞增，RCB整體處于胚乳、胚芽部分。從種皮到胚，RCB呈先減少后增加的趨勢，但于種子中部的豐度最高，主要為胚乳、胚芽，這與RCB的冠狀面分布規(guī)律基本一致，較為清楚地證實(shí)了MALDI-MSI方法的可靠性。

圖5 以3種RCB表示的山西來源種子縱向切片的2D(A～B,A：豐度；B：成像)及3D MALDI-MSI圖(C～D,C：連續(xù)間隔切片；D：半片山西種子的疊合重構(gòu))Fig.5 Three RCB' longitudinal distribution of Shanxi's by total intensity(A),2D MSI abundance(B),3D MALDI-MSI(C) and 3D reconstruction structure of half a Shanxi's seed(D)

另一方面，通過 3D MSI對(duì)上述20片組織切片進(jìn)行立體重構(gòu)，可直觀地觀察到RCB主要分布在胚乳及胚芽中。成熟種子胚乳為營養(yǎng)器官，蓖麻毒素及其凝集素[22]、高豐度的蓖麻油酸同樣富集于胚乳中[23]。

2.5 MALDI-MSI數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步提示RCB的溯源價(jià)值

如圖6A所示，在m/z1 000～4 000 范圍內(nèi)針對(duì)兩地來源的蓖麻籽組織切片進(jìn)行MALDI-MSI采集，分別得到內(nèi)含1 180及1 008個(gè)質(zhì)譜峰的502及579張譜圖，其中多數(shù)為多肽的質(zhì)譜峰。首先選擇在山西、四川蓖麻籽中均存在且豐度較高的14個(gè)代表性m/z進(jìn)行相關(guān)性矩陣分析，發(fā)現(xiàn)3種RCB之間存在高相關(guān)性，且顯著高于其中任何一種其它內(nèi)源性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度印證了3種RCB的內(nèi)在聯(lián)系。

進(jìn)一步利用PCA對(duì)所有的質(zhì)譜峰進(jìn)行降維處理。結(jié)果如圖6B所示，前3個(gè)主成分(Principle components,PCs)的貢獻(xiàn)分別為23.86%、9.73%及6.06%，三者共呈現(xiàn)了39.64%的分布趨勢。整體上，山西與四川蓖麻籽3個(gè)PC所代表的分布趨勢呈現(xiàn)顯著差異；主成分負(fù)載數(shù)據(jù)中，3種RCB均歸屬于貢獻(xiàn)度最高的PC1。提示RCB應(yīng)可做為山西、四川蓖麻籽溯源中的生物標(biāo)志物。3D MSI成像的PCA分析結(jié)果表明，前3個(gè)PC共可貢獻(xiàn)94.16%的主要分布趨勢，涵蓋3種RCB的PC1則貢獻(xiàn)了51.55%的典型性分布。進(jìn)一步說明具有高度內(nèi)在聯(lián)系的RCB 1～3作為一組整體的肽類生物標(biāo)志物，在溯源分析方面存在較高價(jià)值。

圖6 非靶向數(shù)據(jù)挖掘(A：14種山西、四川來源蓖麻籽中共有內(nèi)源肽的相關(guān)性矩陣，*表示3種RCB；B：山西、四川來源蓖麻籽中典型質(zhì)譜峰的PCA分析；C：20片山西來源蓖麻籽中典型質(zhì)譜峰的PCA分析)Fig.6 The non-targeting MSI data mining.(A) Correlation heatmap of all pairs of the 14 representative m/z values in Shanxi's and Sichuan's.RCB 1-3 are indicated by asterisks(*),(B) PCA results of the seeds' section from Shanxi's and Sichuan's,(C) the PCA results of the 20 serial sections from Shanxi's castor bean

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)蓖麻相關(guān)公共安全事件的響應(yīng)處置需求，試圖從蓖麻內(nèi)源防御肽RCB的角度出發(fā)，揭示RCB的組織分布和空間定位與產(chǎn)地溯源間的內(nèi)在聯(lián)系。通過利用首次建立的2D及3D MALDI-MSI方法，明確了RCB的空間分布及豐度差異，并發(fā)現(xiàn)RCB 1～3對(duì)中國南北來源的蓖麻籽溯源可產(chǎn)生較高貢獻(xiàn)度?？紤]到蓖麻毒素呈劇毒毒性，需要特定的安全防護(hù)，而3種防御肽RCB并未呈現(xiàn)明顯真核細(xì)胞毒性這一特點(diǎn)，表明RCB可作為一組安全、靈敏的生物標(biāo)志物，無需借助任何其它特定的輔助步驟(如：胰蛋白酶酶切后肽段定位揭示毒素蛋白差異分布、特定基質(zhì)輔助小分子代謝物的差異成像，等)，便可更為簡便、直觀地助力于中毒事件種子來源的溯源分析。MSI增加了“空間分布”這一維度特征，更適用于準(zhǔn)確地區(qū)分內(nèi)源性組分豐度相似、產(chǎn)地環(huán)境相似的蓖麻籽。進(jìn)一步研究可集中于擴(kuò)大溯源產(chǎn)地范圍，并測試該MALDI-MSI策略的適用性和可靠性，以及開展蓖麻毒素、蓖麻凝集素、蓖麻堿、蓖麻油酸以及蓖麻籽內(nèi)脂質(zhì)小分子等多種類型分子的空間分布分析，并將其與蓖麻毒素的毒性機(jī)制相結(jié)合，從而為法醫(yī)學(xué)、食品安全和環(huán)境安全等提供更全面的科學(xué)依據(jù)。