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持有Pi9基因的水稻單基因系IRBL9-W對(duì)稻瘟病菌苗期和成株期抗性差異

2021-05-18 00:25:48劉樹芳董麗英李迅東周伍民楊勤忠
中國水稻科學(xué) 2021年3期
關(guān)鍵詞:抗病稻瘟病苗期

劉樹芳 董麗英 李迅東 周伍民 楊勤忠, *

持有基因的水稻單基因系IRBL9-W對(duì)稻瘟病菌苗期和成株期抗性差異

劉樹芳1, 2, #董麗英1, 2, #李迅東1, 2周伍民1,3楊勤忠1, 2, *

(1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650205;2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部昆明作物有害生物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站,昆明 650205;3云南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,昆明 650091;#共同第一作者;*通信聯(lián)系人,E-mail: qzhyang@163.com)

是一個(gè)廣譜稻瘟病抗性基因,田間病圃監(jiān)測發(fā)現(xiàn)持有的水稻單基因系IRBL9-W在苗期高抗稻瘟病,但卻感穗瘟。探明水稻單基因系IRBL9-W在苗期抗病而孕穗末期感染穗頸瘟的原因,為基因在水稻抗病育種中的有效利用提供參考。利用從IRBL9-W穗頸瘟病斑上分離的8個(gè)單孢菌株以及實(shí)驗(yàn)室保存的單孢菌株Y363,在溫室分別對(duì)單基因系IRBL9-W苗期和孕穗末期進(jìn)行接種鑒定;并利用病原菌基因的特異引物對(duì)9個(gè)單孢菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序;提取水稻單基因系IRBL9-W苗期葉片和抽穗期穗部的總RNA,通過半定量RT-PCR以及實(shí)時(shí)qRT-PCR分析基因在苗期和穗期的表達(dá)。在溫室人工噴霧接種條件下,IRBL9-W在苗期對(duì)從穗頸瘟上分離的8個(gè)單孢及對(duì)照菌株Y363均表現(xiàn)為抗??;隨機(jī)選取的2個(gè)從IRBL9-W穗頸瘟病樣分離的單孢菌株(YX2-7-1和YX2-15-1)及對(duì)照菌株Y363對(duì)孕穗末期IRBL9-W注射接種,接種的植株表現(xiàn)出典型的穗頸瘟癥狀;的等位基因分析結(jié)果表明,與相比,Y363中的等位基因與完全相同,而從IRBL9-W穗瘟分離的8個(gè)單孢菌株中編碼區(qū)與基因完全相同,但在編碼起始位置上游?264 bp處缺失16 bp的一段序列。由于IRBL9-W苗期對(duì)這些菌株均表現(xiàn)抗病,推測這段序列的缺失并不影響基因的功能;實(shí)時(shí)qRT-PCR分析結(jié)果表明,基因在穗部的表達(dá)量為苗期葉片表達(dá)量的47.3%。在水稻單基因系IRBL9-W中,與苗期葉片中基因的表達(dá)量相比,基因在穗部表達(dá)量的明顯降低可能是造成IRBL9-W穗期感稻瘟病的原因。

水稻;稻瘟病菌;;苗期;成株期

水稻(L.)是世界上最重要的糧食作物之一,作為全球近半數(shù)人口的主食,在糧食安全中具有特殊的重要性。由真菌(無性態(tài)為)[1]引起的水稻稻瘟病是世界水稻產(chǎn)區(qū)危害最為嚴(yán)重的病害之一[2,3],不僅能侵染水稻的地上部分,同時(shí)也能侵染根部[3-4]。稻瘟病每年可造成10%~30%的水稻產(chǎn)量損失,嚴(yán)重的田塊甚至絕收[3,5-6]。稻瘟病在田間常見的癥狀有葉瘟和穗瘟,葉瘟發(fā)生在水稻的營養(yǎng)生長階段,在葉片上形成典型的紡錘形壞死病斑;而穗瘟發(fā)生在水稻的生殖生長階段,病原菌感染水稻的穗頸基部、穗節(jié)或谷粒,造成穗??瞻T,導(dǎo)致水稻嚴(yán)重減產(chǎn)[7]。

“水稻-稻瘟病菌”的互作模式符合Flor的“基因?qū)颉奔僬f,即持有特定抗病基因的水稻品種與病原菌互作時(shí),只有病原菌持有與該抗性基因相對(duì)應(yīng)的無毒基因時(shí),品種才表現(xiàn)出抗性,其他任何一種情況下品種均表現(xiàn)感病[8-10],水稻稻瘟病菌模式已成為植物-真菌致病系統(tǒng)研究中的一種重要模式系統(tǒng)[11]。生產(chǎn)實(shí)踐證明,抗性品種的合理利用是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)境友好的措施。通過廣泛的遺傳分析,從水稻中鑒定并已定位了100多個(gè)主效抗性基因,其中28個(gè)已被克隆[12]。相較于穗瘟抗性在評(píng)價(jià)中存在的周期長、工作量大等問題,苗期人工接種周期短、穩(wěn)定性好、效率高,在抗性遺傳分析與抗性基因的挖掘中被廣泛采用。在已鑒定的稻瘟病抗性基因中,絕大部分的基因是通過對(duì)苗期葉瘟的抗性解析并定位的,而僅有少部分的基因同時(shí)進(jìn)行了葉瘟和穗瘟的抗性分析[13-15];來自秈稻品種谷梅2號(hào)的[13]和來自云南粳稻地方品種Yangmaogu的[14]既抗葉瘟也抗穗瘟,而來自日本秈稻品種Modan的抗病基因抗穗瘟卻不抗葉瘟[15]。已克隆的、和均編碼具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸結(jié)構(gòu)域(nucleotide- binding site and leucine-rich repeat, NBS-LRR)的蛋白,是已克隆的植物抗病基因中最多的一種類型[14,16-17]。Fang等[18]將來源于太湖流域的粳稻地方品種Bodao中的一個(gè)穗瘟抗性數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)精細(xì)定位到水稻第11染色體長臂末端40.6 kb的物理區(qū)間內(nèi);而Wang等[19]將太湖流域的另一個(gè)粳稻地方品種Jiangnanwan中兼抗葉瘟和穗瘟的QTL精細(xì)定位到水稻第11染色體長臂末端282 kb的物理區(qū)間內(nèi);所在區(qū)域涵蓋了所在的位置,目前這2個(gè)基因是等位還是緊密連鎖尚不清楚。通過廣泛的遺傳分析,目前已鑒定并定位了近20個(gè)抗穗瘟或兼抗葉瘟的主效抗性基因或QTL[12]。這些穗瘟抗性主效基因/QTL位點(diǎn)的定位,為開展基因的克隆并進(jìn)一步闡明葉、穗瘟抗性的關(guān)系提供了良好的研究素材。

來源于小粒野生稻()的基因編碼NBS-LRR蛋白[20],對(duì)13個(gè)國家的43個(gè)稻瘟病菌株均表現(xiàn)出很高的葉瘟抗性,具有廣譜抗病的特點(diǎn)[21];后續(xù)的大量研究進(jìn)一步驗(yàn)證了其對(duì)葉瘟抗性的有效性[22-25]。有意思的是,2016年我們對(duì)田間病圃用于監(jiān)測稻瘟病菌群體致病性的24個(gè)以麗江新團(tuán)黑谷為遺傳背景的水稻單基因鑒別系進(jìn)行穗瘟抗性監(jiān)測時(shí),發(fā)現(xiàn)苗期高抗葉瘟的水稻單基因系IRBL9-W()感染穗瘟。為進(jìn)一步研究IRBL9-W感染穗瘟的原因,本研究用分離自該水稻單基因系IRBL9-W穗瘟標(biāo)樣的單孢菌株,在溫室對(duì)苗期和孕穗末期的IRBL9-W進(jìn)行稻瘟病菌接種分析,并采用分子檢測技術(shù)和方法,以嘗試解析IRBL9-W在苗期及穗期抗性差異的原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2016年從水稻單基因系IRBL9-W上采集的8個(gè)穗頸瘟病樣上分別分離的8個(gè)單孢菌株以及實(shí)驗(yàn)室保存的單孢菌株Y363,以及由國際水稻研究所Kobayashi N博士提供的以麗江新團(tuán)黑谷為遺傳背景的24個(gè)持有不同抗病基因的單基因系及對(duì)照感病品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)(表1),用于本研究。

表1 稻瘟病菌單孢菌株在單基因系上的致病性測定

R-抗性;S-感病。

R, Resistance; S, Susceptible.

1.2 葉瘟接種評(píng)價(jià)

首先將低溫保存于濾紙片上的8個(gè)水稻單基因系IRBL9-W穗瘟標(biāo)樣上分別分離的8個(gè)稻瘟病菌單孢菌株(YX2-2-1, YX2-3-2, YX2-5-1, YX2-6-1, YX2-10-1, YX2-14-1, YX2-7-1, YX2-15-1)以及對(duì)照菌株Y363在PDA培養(yǎng)基上活化備用;24個(gè)單基因鑒別系及對(duì)照LTH在浸種催芽后,在溫室用鑷子播于裝有秧田土的 12 cm×18 cm×5 cm塑料育苗盒內(nèi),每品種播5粒,設(shè)3次重復(fù);濾紙片上長期保存的菌株活化于PDA斜面培養(yǎng)基上,在水稻材料播種7 d后分別將供試菌株接種于燕麥培養(yǎng)基上;待水稻苗長至3.5葉期時(shí),采用噴霧接種法將單孢菌株分別接種到單基因鑒別系上,7 d后調(diào)查抗感反應(yīng)的表型。稻瘟病菌培養(yǎng)、接種及調(diào)查方法參照董麗英等[23]的方法進(jìn)行。

1.3 水稻穗頸瘟接種評(píng)價(jià)

在溫室將水稻單基因系IRBL9-W移栽在高度為25 cm,直徑為30 cm的圓形黑色塑料桶中,每桶移栽5苗。當(dāng)單基因系IRBL9-W生長至孕穗末期時(shí),分別選取15株孕穗末期的水稻植株,并掛牌編號(hào)用于稻瘟病菌YX-2-7-1,2016YX-2-15-1和Y363的接種;每個(gè)單株用1 mL醫(yī)用注射器在劍葉葉鞘近基部緩慢注入1 mL的孢子懸浮液至葉鞘內(nèi);15株對(duì)照單株分別注射1 mL不含稻瘟病菌孢子的接種液。接種后的水稻植株放置于保濕培養(yǎng)箱(IKEDA)中25℃黑暗培養(yǎng)24 h,之后轉(zhuǎn)移至溫室繼續(xù)培養(yǎng),4周后進(jìn)行穗瘟的調(diào)查;稻瘟病菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備同葉瘟實(shí)驗(yàn);調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照劉水芳[26]等。

1.4 AvrPi9基因的PCR檢測

根據(jù)已克隆的無毒基因[27](登錄號(hào)為KM004023.1)的序列,利用Oligo 7軟件分別在起始密碼子上游661 bp及終止密碼子下游137 bp處設(shè)計(jì)擴(kuò)增的特異引物,擴(kuò)增片段長度為1141 bp,引物序列為AvrPi9F,5′-GGTCCACTGCT CCATCTTGTTTG-3′;AvrPi9R,5′-CCCTTCTGCGC ATTACTGATACC-3′。通過PCR擴(kuò)增9個(gè)稻瘟病菌菌株中的等位基因,并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。稻瘟病菌用液體培養(yǎng)基(每1 mL培養(yǎng)基含10 g蔗糖、2 g KH2PO4、2 g 酵母粉)在25℃下培養(yǎng)4 d,收集菌絲后用真菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。用分光光度計(jì)(NP80 Touch,IMPLEN)檢測其濃度,并配制濃度為10 ng/μL的DNA工作液。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系25 μL,其中含有2×Esmix 12.5 μL、10 μmol/L AvrPi9F引物1 μL、10 μmol/LAvrPi9R引物1 μL、10 ng/μL模板DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增在C1000(Bio Rad)上進(jìn)行, PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:95℃下預(yù)變性3 min;95℃下變性30 s,55℃下退火30 s,72℃下延伸90 s,共32個(gè)循環(huán);最終72℃下延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取1.5 μL 在1% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行水平電泳并檢測(圖2),剩余的樣品進(jìn)行測序。

1.5 第1鏈cDNA的合成及半定量RT-PCR

采用OminiPlant RNA Kit(DNase I)提取IRBL9-W苗期葉片和孕穗末期穗部組織的總RNA。分別取1 μg的苗期葉片和穗部組織的總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,TAKARA)根據(jù)說明書的操作進(jìn)行第1鏈cDNA的合成,反應(yīng)總體積為20 μL,反應(yīng)結(jié)束后加入20 μL的滅菌超純水將第1鏈cDNA稀釋備用。半定量RT-PCR利用的特異引物NBS2-G和NBS2-H進(jìn)行擴(kuò)增,并以作為內(nèi)參基因,內(nèi)參基因的正向引物為5′-CGTCTGCGATAATGGA ACTGG-3′,反向引物為5′- CTGCTGGAATGTGCT GAGAGA-3′[20]。分別以葉片和穗部組織逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增;PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系20 μL,其中含有2×Esmix 10 μL、10 μmol/L正向引物1 μL 、10 μmol/L反向引物1 μL 、模板cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL,PCR擴(kuò)增在C1000(BioRad)上進(jìn)行,PCR擴(kuò)增基因的反應(yīng)循環(huán)數(shù)為22個(gè),擴(kuò)增基因的反應(yīng)循環(huán)數(shù)分別為25、28、30、33個(gè);PCR條件如下:95℃下預(yù)變性3 min;95℃下變性30 s,62℃下退火40 s,72℃下延伸1 min;最終延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取3 μL在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行水平電泳檢測。

1.6 實(shí)時(shí)qRT-PCR檢測

采用前面描述的方法用苗期葉片及穗部提取的總RNA合成第1鏈cDNA,然后用2 μL 第1鏈cDNA反應(yīng)液作模板進(jìn)行qRT-PCR。擴(kuò)增的引物組合為NBS2-G/NBS2-H,為內(nèi)參基因[20]。選用SYBR Green試劑(iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix,Bio Rad),設(shè)3次重復(fù),qRT-PCR擴(kuò)增在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio-RAD CFX96 Real-Time PCE Dection System)上進(jìn)行分析。qRT-PCR體系為20 μL,含有2×SYBR Green Supermix 10 μL,cDNA模板2 μL,10 μmol/L的正反向引物各0.6 μL,ddH2O 6.8 μL。qRT-PCR條件如下:95℃下預(yù)變性30 s;95℃下變性5 s,62℃下退火延伸60 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻單基因系IRBL9-W在溫室苗期和穗期接種鑒定分析

用以麗江新團(tuán)黑谷為遺傳背景的24個(gè)水稻單基因鑒別系,在3.5葉期接種上述9個(gè)稻瘟病菌株,7 d后調(diào)查表型。接種結(jié)果顯示(表1),接種9個(gè)菌株的對(duì)照感病品種麗江新團(tuán)黑谷均發(fā)病,表明這9個(gè)菌株均具有致病活性,且對(duì)不同的單基因系均表現(xiàn)出不同的抗感反應(yīng)類型,致病類型呈現(xiàn)出多樣性。而單基因系IRBL9-W在苗期對(duì)全部9個(gè)菌株均表現(xiàn)抗病,表明9個(gè)菌株均持有與抗病基因?qū)?yīng)的無毒基因。

利用隨機(jī)選取的2個(gè)分離自穗頸瘟病樣的單孢菌株(YX-2-7-1和YX-2-15-1)及對(duì)照菌株Y363,在水稻孕穗末期通過注射接種的方法分別接種15個(gè)單穗。結(jié)果顯示,接種稻瘟病菌懸浮液的植株感染穗瘟,形成白穗、空癟(表2,圖1-A~C),表明本研究使用的3個(gè)稻瘟病菌菌株能成功侵染稻穗,引起穗瘟的發(fā)生。而用不含稻瘟病菌孢子的接種液接種的15株IRBL9-W的穗部未見任何癥狀,表明不含孢子的接種液對(duì)植株的正常生長沒有影響。

2.2 AvrPi9基因檢測及測序分析

為驗(yàn)證苗期致病性測定分析推斷9個(gè)菌株均含有基因的結(jié)果,利用根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)上述9個(gè)單孢菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得一條特異性擴(kuò)增并與預(yù)期分子量大小相當(dāng)?shù)臈l帶(圖2);PCR產(chǎn)物測序分析結(jié)果表明,Y363中擴(kuò)增的序列與的序列完全相同,而8個(gè)從IRBL9-W感病的穗瘟病斑上分離的8個(gè)單孢菌株的序列在基因的編碼區(qū)與的完全相同,但在編碼起始位點(diǎn)(ATG)上游?264~?279 bp位置的16個(gè)堿基缺失。結(jié)合苗期9個(gè)菌株接種IRBL9-W均不致病,表明這16 bp序列的缺失對(duì)基因的功能沒有影響。

2.3 半定量RT-PCR電泳分析

為進(jìn)一步分析基因在苗期和成株期抗性反應(yīng)差異的原因,采用半定量RT-PCR對(duì)抗病基因苗期葉片和抽穗期穗部的表達(dá)進(jìn)行分析,以基因作為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示,當(dāng)擴(kuò)增至22個(gè)循環(huán)時(shí),內(nèi)參基因的表達(dá)便能檢測到,且擴(kuò)增產(chǎn)物帶型的亮度相近;而基因的表達(dá)需要到25個(gè)循環(huán)時(shí)才能檢測到,且隨著循環(huán)數(shù)的增加PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶更加明顯,結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)穗部組織的表達(dá)量明顯低于苗期葉片組織中的表達(dá)量(圖3-A)。綜合IRBL9-W()在苗期接種的抗病表型,孕穗末期穗部接種相同的菌株時(shí)IRBL9-W則出現(xiàn)感病的反應(yīng),表明表達(dá)量的降低是感穗瘟的原因。

a-植株數(shù)量;b-不含稻瘟病菌孢子的接種液。

arefers to the number of plants;brefers to inoculation solution withoutspores.

A~C-IRBL9-W接種菌株YX2-7-1、YX2-15-1和Y363在孕穗末期的癥狀; D~F-IRBL9-W(左)和麗江新團(tuán)黑谷(右)苗期接種菌株YX2-7-1、YX2-15-1和Y363后的癥狀。

Fig. 1. Symptoms of monogenic line IRBL9-W inoculated withfungus at late-booting stage and seedling stage.

2.4 實(shí)時(shí)qRT-PCR擴(kuò)增檢測

為驗(yàn)證并檢測在苗期及成株期表達(dá)的差異,通過實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR進(jìn)一步檢測了基因在兩個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果表明,在苗期葉片組織和成株期穗部組織的表達(dá)量確實(shí)存在顯著差異,而且穗部組織的表達(dá)量僅為苗期葉片組織的47.3%(圖3-B);結(jié)果進(jìn)一步說明,當(dāng)基因的表達(dá)量降至苗期表達(dá)量的近47.3%時(shí),植株已不能正常防御稻瘟病菌的浸染。

M-DNA分子量標(biāo)記; 條帶1~9分別指稻瘟病菌菌株YX2-2-1, YX2-3-2, YX2-5-1, YX2-6-1, YX2-10-1, YX2-14-1, YX2-7-1, YX2-15-1和Y363。

Fig. 2. Amplification offrom differentstrains.

A-Pi9基因的半定量分析。從成株期穗部(P)及苗期葉片(L)制備的cDNA用作PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增,Actin1用作內(nèi)參基因;B-實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR比較分析Pi9基因在苗期和穗期的表達(dá)量。

Fig. 3. Expression level ofgene.

3 討論

在水稻抗稻瘟病基因的研究中發(fā)現(xiàn),盡管有些水稻品種/品系的抗病基因/QTL對(duì)葉瘟和穗瘟的抗性表現(xiàn)正相關(guān)[7, 13, 14, 16, 19],但有些水稻品種抗性基因的葉瘟與穗瘟卻表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)[7]。如對(duì)穗瘟有較好的抗性,但在營養(yǎng)生長階段卻由于基因的過低表達(dá)而感染葉瘟[17],而來源于Zhong156的(t)基因能有效抵抗稻瘟病菌株92-183的葉瘟侵染,但不能阻止其穗瘟侵染[13],表明抗性基因?qū)θ~、穗瘟的抗性存在差異。大量的苗期接種研究表明,在苗期對(duì)葉瘟具有廣譜抗性[21-25]。本研究利用3個(gè)稻瘟病菌菌株在抽穗期接種發(fā)現(xiàn)IRBL9-W表現(xiàn)出典型的感病癥狀,表明基因在穗期未能像苗期一樣表現(xiàn)出良好的抗病能力,而Wu等研究近等基因系稻瘟病抗性時(shí)也曾報(bào)道基因在苗期葉瘟抗性優(yōu)于穗瘟抗性的現(xiàn)象[28-29]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),與苗期葉片組織中的表達(dá)量相比,基因在穗部組織的相對(duì)表達(dá)量僅為苗期葉片組織的47.3%,表明基因表達(dá)量降低導(dǎo)致IRBL9-W感染穗瘟,也進(jìn)一步說明組成型表達(dá)的抗性基因必須達(dá)到一定的表達(dá)豐度后才能有效抵抗稻瘟病菌的入侵。目前對(duì)抗病基因在苗期葉片組織與抽穗期穗部組織表達(dá)豐度比較的報(bào)道不多。Hayashi等發(fā)現(xiàn)在苗期由于表達(dá)量低而表現(xiàn)出感病,但通過過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)量的增加可以提高對(duì)葉瘟的抗性[17],以及苗期、穗期均具有類似的高表達(dá)量的基因表現(xiàn)出兼抗葉瘟和穗瘟的表型[14],支持了本研究中基因在穗期感病是由于穗期穗部組織的表達(dá)量比苗期葉片組織表達(dá)量低的推論。對(duì)不同抗性基因的深入研究,將進(jìn)一步闡明基因的表達(dá)量與抗性表型之間的關(guān)系,這對(duì)于有效選擇標(biāo)靶基因開展稻瘟病抗性育種具有很好的促進(jìn)作用。

稻瘟病菌無毒基因中堿基序列的插入/缺失、轉(zhuǎn)座子/反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入可導(dǎo)致無毒基因功能的喪失,而使得持有無毒基因相應(yīng)抗病基因的品種表現(xiàn)出感病[30]。在本研究中,分離自IRBL9-W感病的8個(gè)獨(dú)立病斑的單孢菌株中基因在其編碼區(qū)上游?264~?279 bp位置發(fā)生一段16bp (TCTCC TACACTGGGGC)序列的缺失,但編碼區(qū)序列未發(fā)生任何改變,且苗期接種IRBL9-W時(shí),IRBL9-W表現(xiàn)為抗病反應(yīng),在IRBL9-W孕穗末期注射接種時(shí),IRBL9-W感染穗頸瘟,與含有完整基因的菌株Y363表現(xiàn)出相同的結(jié)果,表明編碼區(qū)上游這16 bp的缺失并不影響這些菌株中的正常識(shí)別功能。

在水稻抗稻瘟病育種中,闡明所用靶標(biāo)基因?qū)θ~瘟和穗瘟的抗性特性是進(jìn)行抗性基因聚合育種的關(guān)鍵。近年來,由于抗病基因在苗期表現(xiàn)出廣譜的抗病特性而在水稻抗病分子育種中被廣泛應(yīng)用[30-33]。而本研究揭示出不抗穗瘟問題,這給如何更好地利用基因解決稻瘟病的抗性提出了新的挑戰(zhàn);有效聚合廣譜抗葉瘟的基因以及其他抗穗瘟或兼抗葉、穗瘟的基因,以拓寬品種的抗譜,如與、等基因的聚合,以選育抗葉、穗瘟的新品種,賦予品種持久抗性。如何有效提高基因在成株期的表達(dá)量來提高其穗瘟抗性能力是需要進(jìn)一步探索的問題。

本研究采用從感染穗頸瘟的病斑上分離的單孢菌株來分析基因?qū)θ~、穗瘟的抗感反應(yīng)評(píng)價(jià),研究結(jié)果揭示出基因在苗期抗葉瘟但不抗穗瘟。在實(shí)際生產(chǎn)中,此方法也可用于其他抗性基因開展類似的研究,以揭示特定抗病基因是否同樣存在葉、穗瘟抗性差異的問題,可為品種葉、穗瘟抗性的評(píng)價(jià)提供借鑒和參考。

[1] Couch B C, Kohn L M. A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species,, from[J]., 2002, 94(4): 683-693.

[2] Wilson R A, Talbot N J. Under pressure: Investigating the biology of plant infection by[J]., 2009, 7: 185-195.

[3] Savary S, Willocquet L, Pethybridge S J, Esker P, McRoberts N, Nelson A. The global burden of pathogens and pests on major food crops[J]., 2019, 3(3): 430-439.

[4] Sesma A, Osbourn A E. The rice leaf blast pathogen undergoes developmental processes typical of root-infecting fungi., 2004, 431(7008): 582-586.

[5] Skamnioti P, Gurr S J. Against the grain: Safeguarding rice from rice blast disease[J]., 2008, 27(3): 141-150.

[6] Dean R, van Kan J A L, Pretorius Z A, Hammond-kosack K E, Pietro A D, Spanu P D, Rudd J J, Dickman M, Kahmann R, Ellis J, Foster G D. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology[J]., 2012, 13(4): 414-430.

[7] Puri K D, Shreshta S M, Chhetri G B K, Joshi K D. Leaf and neck blast resistance reaction in tropical rice lines under greenhouse condition[J]., 2009, 165(3): 523-532.

[8] Flor H H. Current status of the gene-for-gene concept[J]., 1971, 9(1): 275-296.

[9] Silué D, Notteghem J L, Tharreau D. Evidence of a gene-for-gene relationship in thepathosystem[J]., 1992, 82: 577-580.

[10] Jia Y, McAdams S A, Bryan G T, Hershey H P, Valent B. Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance[J]., 2000, 19: 4004-4014. https://doi. org/10.1093/ emboj/19.15.4004 PMID: 10921881.

[11] Ebbole D J.as a model for understanding host-pathogen interactions[J]., 2007, 45(1): 437-456.

[12] Kalia S, Rathour R. Current status on mapping of genes for resistance to leaf and neck-blast disease in rice[J]., 2019, 9: 209.

[13] Zhuang J Y, Ma W B, Wu J L, Chai R Y, Lu J, Fan Y Y, Jin M Z, Leung H, Zheng K L. Mapping of leaf and neck blast resistance genes with resistance gene analog, RAPD and RFLP in rice[J]., 2002, 128: 363-370.

[14] Ma J, Lei C, Xu X, Hao K, Wang J, Cheng Z, Wan J., encoding a novel CC-NBS-LRR protein, confers resistance to leaf and neck blast in rice[J]., 2015, 28(5): 558-568.

[15] Fujii K, Hayano-Saito Y, Saito K, Sugiura N, Hayashi N, Tsuji T, Izawa T, Iwasaki M. Identification of a RFLP marker tightly linked to the panicle blast resistance gene,, in rice[J]., 2000, 50: 183-188.

[16] Chen J, Shi Y F, Liu W Z, Chai R Y, Fu Y P, Zhuang J Y, Wu J L. Aallele from rice cultivar Gumei 2 confers resistance to[J]., 2011, 38: 209-216.

[17] Hayashi N, Inoue H, Kato T, Funao T, Shirota M, Shimizu T, Kanamori H, Yamane H, Hayano-Saito Y, Matsumoto T, Yano M, Takatsuji H. Durable panicle blast-resistance geneencodes an atypical CC-NBS-LRR protein and was generated by acquiring a promoter through local genome duplication[J]., 2010, 64(3): 498-510.

[18] Fang N, Wei X, Shen L, Yu Y, Li M, Yin C, He W, Guan C, Chen H, Zhang H, Bao Y. Fine mapping of a panicle blast resistance geneinlandrace Bodao and its application in rice breeding[J]., 2019, 12(1): 18.

[19] Wang R, Fang N, Guan C, He W, Bao Y, Zhang H. Characterization and fine mapping of a blast resistant genefrom therice landrace Jiangnanwan [J].,2016, 11(12): e0169417. doi: 10. 1371/journal. pone. 0169417.

[20] Qu S, Liu G, Zhou B, Bellizzi M, Zeng L, Dai L, Han B, Wang G L. The broad-spectrum blast resistance geneencodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J]., 2006, 172(3): 1901-1914.

[21] Liu G, Lu G, Zeng L, Wang G L. Two broad-spectrum blast resistance genes,(t) and(t), are physically linked on rice chromosome 6[J]., 2002, 267(4): 472-480.

[22] 雷財(cái)林, 張國民, 程治軍, 馬軍滔, 王久林, 辛愛華, 陳平, 肖家雷, 張欣, 劉迎雪, 郭秀平, 王潔, 翟虎渠, 萬建民. 黑龍江省稻瘟病菌生理小種毒力基因分析與抗病育種策略[J]. 作物學(xué)報(bào), 2011, 37(1): 18-27.

Lei C L, Zhang G M, Cheng Z J, Ma J T, Wang J L, Xin A H, Chen P, Xiao J L, Zhang X, Liu Y X, Guo X P, Wang J, Zhai H Q, Wan J M. Pathogenic races and virulence gene structure ofpopulation and rice breeding strategy for blast resistance in Heilongjiang Province[J]., 2011, 37(1): 18-27. (in Chinese with English abstract)

[23] 董麗英, 王群, 劉樹芳, 鄭鳳萍, 李迅東, 楊勤忠. 云南省稻瘟病菌群體對(duì)稻瘟病抗性單基因系的致病性分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 25(2): 467-473.

Dong L, Wang Q, Liu S, Zheng F, Li X, Yang Q. Pathogenicity analysis ofpopulations of Yunnan on monogenic lines for resistance to rice blast[J]., 2012, 25(2): 467-473. (in Chinese with English abstract)

[24] 汪文娟, 蘇菁, 楊健源, 韋小燕, 陳凱玲, 陳珍, 陳深, 朱小源. 源于廣8A 雜交稻組合的稻瘟病菌無毒基因型分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51(24): 4633-4646.

Wang W J, Su Q, Yang J Y, Wei X Y, Chen K L, Chen Z, Chen S, Zhu X Y. Analysis ofavirulent genes in the infected hybrid rice combinations derived from a sterile line of Guang 8A[J]., 2018, 51(24): 4633-4646. (in Chinese with English abstract)

[25] Wang J C, Jia Y, Wen J W, Liu W P, Liu X M, Li L, Jiang Z Y, Zhang J H, Guo X L, Ren J P. Identification of rice blast resistance genes using international monogenic differentials[J]., 2013, 45: 109-116.

[26] 劉水芳, 楊秀榮, 孫淑琴, 劉春艷, 王勇, 張春祥, 顧紅艷. 水稻品種抗稻瘟病鑒定技術(shù)[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 13(4): 55-58.

Liu S, Yang X, Sun S, Liu C, Wang Y, Zhang C, Gu H. Identification technique of rice resistance to[J]., 2007, 13(4): 55-58. (in Chinese)

[27] Wu J, Kou Y J, Bao J D, Li Y, Tang M Z, Zhu X L, Ponaya A, Xiao G, Li J B, Li C Y, Song M Y, Cumagun C J R, Deng Q Y, Lu G D, Jeon J S, Naqvi N, Zhou B. Comparative genomics identifies theavirulence effectorthat triggers-mediated blast resistance in rice[J]., 2015, 206(4): 1463-1475.

[28] Wu Y Y, Yu L, Pan C H, Dai Z Y, Li Y H, Xiao N, Zhang X X, Ji H J, Huang N S, Zhao B H, Zhou C H, Liu G Q, Liu X J, Pan X B, Liang C Z, Li A H. Development of near-isogenic lines with different alleles oflocus and analysis of their breeding effect under Yangdao 6 background[J]., 2016, 36: 12.

[29] Wu Y Y, Chen Y, Pan C H, Xiao N, Yu L, Li Y H, Zhang X X, Pan X B, Chen X J, Dai Z Y, Li A H. Development and evaluation of near-isogenic lines with different blast resistance alleles at thelocus inrice from the lower region of the Yangtze River, China[J]., 2017, 101: 1283-1291.

[30] Collard B C Y, Mackill D J. Marker-assisted selection: An approach for precision plant breeding in the twenty-first century.:, 2008, 363: 557-572.

[31] 倪大虎, 易成新, 李莉, 汪秀峰, 王文相, 楊劍波. 利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻基因和[J]. 分子植物育種, 2005, 3(3): 329-334.

Ni D H, Yi C X, Li L, Wang X F, Wang W X, Yang J B. Pyramidingand(t) in rice by marker-assisted selection[J]., 2005, 3(3): 329-334. (in Chinese with English abstract)

[32] 殷得所, 夏明元, 李進(jìn)波, 萬丙良, 査中萍, 杜雪樹, 戚華雄. 抗稻瘟病基因的STS連鎖標(biāo)記開發(fā)及在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用[J]. 中國水稻科學(xué), 2011, 25(1): 25-30.

Yin D S, Xia M Y, Li J B, Wan B L, Zha Z P, Du X S, Qi H X. Development of STS marker linked to rice blast resistance genein marker-assisted selection breeding[J]., 2011, 25(1): 25-30. (in Chinese with English abstract)

[33] 陳建民, 付志英, 權(quán)寶權(quán), 田大剛, 李剛, 王鋒. 分子標(biāo)記輔助培育雙抗稻瘟病和白葉枯病雜交稻恢復(fù)系[J]. 分子植物育種, 2009, 7(3): 465-470.

Chen J M, Fu Z Y, Quan B Q, Tian D G, Li G, Wang F. Breeding hybrid rice restoring line with double resistance to rice blast and bacterial blight by marker-assisted selection[J]., 2009, 7(3): 465-470. (in Chinese with English abstract)

Different Reactions of Rice Monogenic Line IRBL9-W HarboringGene toContainingDuring Seedling and Adult-plant Stages

LIU Shufang1, 2, #, DONG Liying1, 2, #, LI Xundong1,2, ZHOU Wumin1,3,YANG Qinzhong1,2,*

(Agricultural Environment Resources Research Institute,/,,;Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Kunming,,,;,,;These authors contributed equally to this work;Corresponding author,)

【】 Thegene confers broad-spectrum resistance against. Rice monogenic line IRBL9-W carrying single blast resistance geneis highly resistant to leaf blast during the seedling stage, but it is susceptible to neck blast at adult-plant stage in blast nursery. It is important to analyze the mechanism behind the reversion of resistance to, which will provide important information for effective utilization ofin disease-resistant rice breeding program.【】Eight single spore strains ofisolated fromneck blast samples of diseased IRBL9-W, and one isolate Y363 were artificially inoculated by spraying at seedling stage to pathotype their pathogenicity on 24 monogenic lines including IRBL9-W. Two out of eight strains and control strain Y363 were further selected and inoculated on IRBL9-W at late-booting stage by injecting to evaluate their pathogenicity. The alleles ofgene cognate to rice blast resistance genewere amplified and sequenced with-specific primers in nine strains. Total RNA of the rice monogenic line IRBL9-W in seedling and late-booting stage was extracted from young leaf and panicle, respectively. The expression analysis ofgene was performed by semi-quantitative RT-PCR and real-time qRT-PCR.【】 The monogenic line IRBL9-W was completely resistant to the ninestrains at the seedling stage exposed to the artificial spraying. However, IRBL9-W was susceptible to panicle blast when inoculated with both two randomly selected strains (YX2-7-1 and YX2-15-1) isolated from panicle blast lesions of IRBL9-W, and the control strain Y363 by injecting inoculation at the late-booting stage. Compared with, allelic sequence amplified from Y363 was identical to cloned, and the coding region of the other eight strains isolated from IRBL9-W panicle blast was identical togene, except for a 16-bp deletion at ?264 bp upstream of the coding starting position in the eight strains. Given high resistance of IRBL9-W to these strains at the seedling stage, we contended that this 16-bp deletion did not affect the function ofgene; qRT-PCR results showed that the relative expression level ofgene in panicle was only 47.3% as compared to that in seedling leaves.【】Compared with the relative expression level ofgene at the seedling stage in IRBL9-W, the significant decrease ofgene expression level in panicle of IRBL9-W could be the cause of susceptibility toat late-booting stage.

L.;;; seedling stage; adult-plant stage

10.16819/j.1001-7216.2021.0717

2020-07-24;

2020-11-24。

云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目(202001AS070006);科技部國家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)(2016YFD0100101);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31860524);云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院基金資助項(xiàng)目(YJZ201803)。

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