黃麗容， 吳月君， 吳依琳， 檀龍顏

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 貴陽 550025)

1 材料與方法

1.1 材 料

越南槐種子于2018年9月采自安順市紫云縣貓營鎮(zhèn)山豆根種繁基地，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院檀龍顏副教授鑒定為豆科植物越南槐(Sophoratonkinensis)的種子。室內(nèi)陰干后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1消毒方法

消毒試劑分別為0.1%升汞、10%雙氧水、2%次氯酸鈉和75%酒精。每種消毒試劑下分別消毒5 min、10 min、20 min。將50粒大小均勻、飽滿的種子置于直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，基質(zhì)為2層定性濾紙(超純水充分潤濕，無明水)。培養(yǎng)皿置于人工智能氣候箱中培養(yǎng)，黑暗，25 ℃。每天09：00時(shí)觀察種子發(fā)芽率、發(fā)霉率、發(fā)芽勢(shì)等情況，發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根突破種皮1 mm以上，發(fā)芽結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)5 d無新發(fā)芽種子為標(biāo)準(zhǔn)[5]，本實(shí)驗(yàn)觀察20 d，試驗(yàn)過程中及時(shí)補(bǔ)水。

1.2.2萌發(fā)條件

溫度設(shè)置15、20、25、30、35 ℃等梯度，光照設(shè)置全光照和全黑暗，發(fā)芽床設(shè)置濾紙、紗布、細(xì)河沙和脫脂棉4種，培養(yǎng)方式同1.2.1。

1.2.3鈣溶液處理及生理指標(biāo)測(cè)定

CaCl2溶液處理濃度分別為0、4、30、50、100、150 mmol·L-1，觀察處理后種子萌發(fā)率、萌發(fā)后苗的根長和芽長變化。遴選最適鈣溶液處理濃度，進(jìn)行含水量、總可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性等生理指標(biāo)測(cè)定。

本次調(diào)查使用自編問卷，內(nèi)容設(shè)置上，在國內(nèi)英語需求分析量表的基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，選項(xiàng)設(shè)置為封閉式選項(xiàng)與李克特等級(jí)選項(xiàng)相結(jié)合的方式，為避免填寫者態(tài)度不明確，在李克特等級(jí)設(shè)置上，采用了四級(jí)結(jié)構(gòu)：非常同意、基本同意、不太同意和非常不同意，去掉了模棱兩可的中立態(tài)度項(xiàng)，其內(nèi)容包括四個(gè)方面：一、英語使用頻率及主要用途，二、英文資料使用狀況，三、英語對(duì)職業(yè)前途的影響，四、英語學(xué)習(xí)需求及途徑。追蹤訪談內(nèi)容在此問卷基礎(chǔ)上進(jìn)行深入及延伸，主要包括了當(dāng)前英文版及其翻譯版資料的具體使用狀況和存在問題以及從業(yè)人員英語學(xué)習(xí)需求兩方面內(nèi)容。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)參考孫長生等[5]的方法。

發(fā)霉率(%)=(終止發(fā)芽時(shí)發(fā)霉的種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

采用Excel 2010軟件和SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)試驗(yàn)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對(duì)越南槐種子萌發(fā)的影響

2.1.1不同消毒方式對(duì)發(fā)芽率的影響

從表1可以看出，用0.1%升汞對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，消毒5 min的種子發(fā)芽率為59%，消毒10 min的種子發(fā)芽率為63%，消毒20 min的種子發(fā)芽率為73%。用10%雙氧水對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，消毒5 min、10 min和20 min的種子發(fā)芽率分別為62%、61%和75%。用2%次氯酸鈉對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，消毒5 min和10 min的發(fā)芽率與前兩種消毒方式相近，分別為63%和62%，但是消毒20 min的種子發(fā)芽率為83%。變化較大的為用75%酒精消毒的種子，消毒5 min的種子發(fā)芽率為71%，消毒10 min的種子發(fā)芽率為55%，消毒20 min的種子發(fā)芽率為41%。

2.1.2不同消毒方式對(duì)發(fā)霉率的影響

從表1可以看出，用0.1%升汞對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，隨著消毒時(shí)間的延長種子發(fā)霉率逐漸下降，消毒5 min、10 min和20 min的種子發(fā)霉率分別為34%、29%和20%。而用10%雙氧水對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，消毒5 min和10 min的種子發(fā)霉率相近，分別為32%和34%；消毒20 min的種子發(fā)霉率為17%。用2%次氯酸鈉對(duì)山豆根種子進(jìn)行消毒，發(fā)現(xiàn)消毒5 min和10 min的種子發(fā)霉率分別為31%和33%，而消毒20 min的種子發(fā)霉率較低，為14%。用75%酒精對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，發(fā)現(xiàn)種子的發(fā)霉率隨著消毒時(shí)間的延長逐漸升高，消毒5 min、10 min和20 min的發(fā)霉率分別為19%、41%和51%。

表1 不同消毒方式對(duì)越南槐種子萌發(fā)的影響

2.1.3不同消毒方式對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響

從表1可以看出，用0.1% 升汞和10%雙氧水對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，相同消毒時(shí)間的種子發(fā)芽勢(shì)相近。而用2%次氯酸鈉對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，發(fā)芽勢(shì)隨著消毒時(shí)間的延長逐漸升高，消毒5 min、10 min和20 min的發(fā)芽勢(shì)分別為25%、29%和37%。而用75%酒精對(duì)越南槐種子進(jìn)行消毒，發(fā)現(xiàn)消毒5 min的發(fā)芽勢(shì)最高，為24%，而消毒10 min和20 min的發(fā)芽勢(shì)較低，分別為11%和10%。

2.2 越南槐種子萌發(fā)的最佳條件

2.2.1光照和溫度對(duì)萌發(fā)率的影響

從表2可以看出，越南槐種子的萌發(fā)率全光照條件下與全黑暗條件下相比普遍較低，所以全黑暗條件較適于越南槐種子的萌發(fā)。從不同溫度梯度下越南槐種子的萌發(fā)率來看，25 ℃下最高，因此25 ℃為越南槐種子萌發(fā)的最適溫度。

表2 溫度和光照對(duì)越南槐種子萌發(fā)率的影響

2.2.2發(fā)芽床對(duì)萌發(fā)率的影響

從表3可看出，濾紙作為發(fā)芽床時(shí)越南槐種子的萌發(fā)率最高，因而濾紙與其他幾種發(fā)芽床相比較好。

表3 發(fā)芽床對(duì)越南槐種子萌發(fā)率的影響

2.3 不同濃度鈣離子對(duì)越南槐種子萌發(fā)的影響

2.3.1萌發(fā)率、苗根長和芽長的變化

從表4可以看出，越南槐種子培養(yǎng)20 d時(shí)，0 mmol·L-1和4 mmol·L-1CaCl2條件下種子萌發(fā)率較高且無明顯差異，30 mmol·L-1CaCl2條件下種子萌發(fā)率略低，50、100 mmol·L-1CaCl2條件下種子萌發(fā)率呈梯度降低趨勢(shì)，且差異明顯。從根長方面看，0 mmol·L-1和4 mmol·L-1CaCl2條件下根長相近且無明顯差異，30、50 mmol·L-1CaCl2條件下根長相近且無明顯差異，但顯著低于0和4 mmol·L-1CaCl2條件。100 mmol·L-1CaCl2條件下根長最短。芽長的變化情況與根長變化情況類似。由于150 mmol·L-1CaCl2條件下，越南槐種子幾乎不萌發(fā)，故未統(tǒng)計(jì)?；谝陨嫌^察結(jié)果，選定0、50、100 mmol·L-1CaCl2作為處理?xiàng)l件。

表4 不同濃度鈣離子對(duì)越南槐種子萌發(fā)率、苗根長和芽長的影響

2.3.2含水量、可溶性糖含量和MDA含量變化

從圖1可以看出，萌發(fā)種子的含水量隨著鈣離子濃度的升高而逐漸降低，萌發(fā)種子中的總可溶性糖含量和MDA含量隨著鈣離子濃度的升高而逐漸增加(圖2、圖3)。萌發(fā)種子含水量和總可溶性糖含量的變化表明，隨著鈣離子濃度的升高，鈣離子對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了滲透脅迫，而MDA含量的升高表明脅迫導(dǎo)致了活性氧自由基的產(chǎn)生，并造成了膜脂的氧化。

圖1 不同濃度鈣離子下萌發(fā)種子含水量的變化

圖2 不同濃度鈣離子下萌發(fā)種子總可溶性糖含量的變化

圖3 不同濃度鈣離子下萌發(fā)種子MDA含量的變化

2.3.3CAT、SOD和POD活性的變化

從圖4、圖5和圖6可以看出，萌發(fā)種子中CAT、SOD、POD等3種抗氧化酶的活性隨著處理濃度的增加逐漸升高，表明在不同濃度鈣脅迫下，萌發(fā)種子中產(chǎn)生的活性氧主要是通過抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行清除。

圖4 不同濃度鈣離子下萌發(fā)種子CAT活性的變化

圖5 不同濃度鈣離子下萌發(fā)種子SOD活性的變化

圖6 不同濃度鈣離子下萌發(fā)種子POD活性的變化

3 結(jié)論和討論

常用的種子消毒試劑均可用于越南槐種子消毒，但是不同消毒試劑、不同消毒時(shí)間均可對(duì)種子萌發(fā)造成嚴(yán)重的影響。從發(fā)芽率、發(fā)霉率和發(fā)芽勢(shì)角度綜合考慮，認(rèn)為越南槐種子最佳消毒方式為2%次氯酸鈉消毒20 min。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，用0.1%升汞、10%雙氧水和2%次氯酸鈉3種試劑處理種子時(shí)，結(jié)果表現(xiàn)出相似的規(guī)律，但75%酒精處理種子時(shí)的結(jié)果表現(xiàn)出與以上3種試劑相反的規(guī)律。張榮超等[6]認(rèn)為，利用乙醇能改變種子的生理生化特性，特別是酶的活性，這為本研究結(jié)果在一定程度上提供了佐證，但具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。唐喜亮等[7]也認(rèn)為，消毒方式對(duì)種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均有重要的影響，并在研究天山雪蓮(Saussureainvolucrata)種子萌發(fā)特性時(shí)采用多種試劑混合消毒的方式。本研究結(jié)果認(rèn)為，在進(jìn)行混合試劑消毒試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)選取0.1%升汞、10%雙氧水和2%次氯酸鈉3種試劑進(jìn)行混合使用。

溫度、光照和基質(zhì)作為種子萌發(fā)的基本條件能夠顯著影響種子的萌發(fā)。檀龍顏等[8]研究表明，羊耳菊(Inulacappa)種子的最佳萌發(fā)溫度是25 ℃，與本研究的越南槐種子萌發(fā)的最佳溫度相同，但是苦參(Sophoraflavescen)種子的最佳萌發(fā)溫度為15 ℃[9]，因此，不同植物種子萌發(fā)對(duì)溫度的需求是有差異的。多數(shù)植物的種子萌發(fā)不需要光照，僅少數(shù)種子需要，如白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa)[10]，且檀龍顏等[8]在羊耳菊研究中發(fā)現(xiàn)，光照對(duì)種子萌發(fā)有一定的益處，但本研究發(fā)現(xiàn)黑暗條件更適于越南槐種子的萌發(fā)。此外，不同基質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)具有顯著的影響[11]，如腐殖質(zhì)更適于瑪咖(Lepidiummeyenyeni)種子的萌發(fā)[11]，細(xì)河沙更適于羊耳菊種子的萌發(fā)[8]，而本研究發(fā)現(xiàn)濾紙更適合越南槐種子的萌發(fā)。因此，在對(duì)不同植物種子篩選萌發(fā)條件時(shí)，必須綜合考察各種因素。

盡管鈣離子在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用，但過量的鈣離子對(duì)植物的生長有抑制作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，污水淤泥中的高濃度(92.1 mmol·L-1)鈣離子能夠明顯抑制蘿卜(Raphanussativus)種子萌發(fā)及初生根的生長[12]。從本研究結(jié)果來看，隨著鈣離子濃度的增加，萌發(fā)種子的含水量降低、總可溶性糖升高說明產(chǎn)生了滲透脅迫，而MDA含量升高表明膜脂遭到了氧化即產(chǎn)生了活性氧自由基，而幾種抗氧化酶活性的逐漸升高則表明越南槐種子萌發(fā)過程中主要是依靠抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)活性氧進(jìn)行清除的。這可能也是越南槐比較適應(yīng)貴州和廣西的喀斯特山地土壤環(huán)境的一個(gè)原因。