劉 丹,梁 丹,王麗娜,朱 銘,張 明,李素敏, 胡亞南,王從磊,時(shí)曉偉,馮 剛,王建賀

(1.天津市農(nóng)作物研究所，天津市農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河南周口 466000；3.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北唐山 063000)

中國(guó)強(qiáng)筋小麥育種起步較晚，近年來(lái)育成品種中大多數(shù)為中筋品種，強(qiáng)筋小麥品種占比較小，且推廣面積較小。目前，國(guó)內(nèi)大多數(shù)強(qiáng)筋小麥品種品質(zhì)指標(biāo)與國(guó)際強(qiáng)筋小麥如加麥、美國(guó)DNS還有差距，不能滿(mǎn)足面粉企業(yè)的要求[1]。只有少部分如‘師欒02-1’‘濟(jì)南17’‘新麥26’和‘中麥578’等冬小麥品種能夠達(dá)到面粉企業(yè)的要求[2-5]。選育強(qiáng)筋冬小麥品種，使國(guó)內(nèi)強(qiáng)筋小麥種植面積提高，其品質(zhì)達(dá)到美國(guó)、加拿大等國(guó)強(qiáng)筋小麥的標(biāo)準(zhǔn)，可緩解中國(guó)優(yōu)質(zhì)小麥原糧過(guò)度依賴(lài)進(jìn)口的難題。

天津市農(nóng)作物研究所育成的春小麥品種‘津強(qiáng)1號(hào)’為引自加拿大的‘CSR17’的變異株系，品質(zhì)達(dá)到強(qiáng)筋小麥標(biāo)準(zhǔn)，可替代進(jìn)口強(qiáng)筋面粉[6]，亞基分析表明，‘津強(qiáng)1號(hào)’品種中含有的優(yōu)質(zhì)亞基Bx7OE及Dx5+Dy10，對(duì)津強(qiáng)系列高筋品質(zhì)起到重要的作用。筆者課題組通過(guò)前期分子標(biāo)記和谷蛋白SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，中國(guó)的冬小麥中部分品種存在Dx5+Dy10亞基，但未發(fā)現(xiàn)含有Bx7OE亞基的材料，因此可以通過(guò)導(dǎo)入Bx7OE亞基及Dx5+Dy10亞基對(duì)冬小麥品種的品質(zhì)進(jìn)行改良提升。

研究表明，麥谷蛋白占小麥籽粒蛋白總量的40%左右，與小麥醇溶蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用形成面筋[7]，其中谷蛋白決定了面團(tuán)的彈性，醇溶蛋白決定了面團(tuán)的延展性和粘性[8]。谷蛋白在SDS-PAGE電泳中的遷移速率可分為高分子質(zhì)量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子質(zhì)量谷蛋白亞基(LMW-GS)[9-12]。高分子質(zhì)量谷蛋白亞基對(duì)品質(zhì)的貢獻(xiàn)不盡相同，對(duì)強(qiáng)筋品質(zhì)起到了正向作用的5+10亞基為優(yōu)質(zhì)亞基[13-14]，而2+12對(duì)強(qiáng)筋品質(zhì)起到了負(fù)調(diào)作用[15]；優(yōu)質(zhì)亞基Bx7OE研究發(fā)現(xiàn)，該亞基的存在使得小麥品質(zhì)顯著提升，其作用機(jī)理為染色體上存在兩個(gè)串聯(lián)的Bx7亞基，兩個(gè)編碼Bx7亞基基因中存在一個(gè)逆轉(zhuǎn)座子(LTR)，改變了染色體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Bx7亞基的超量表達(dá)(Bx7OE亞基)[16- 17]。美國(guó)、加拿大優(yōu)質(zhì)小麥中普遍存在Bx7OE亞基，并且在育種中廣泛利用，部分國(guó)家已經(jīng)將Bx7OE亞基作為主要育種目標(biāo)。根據(jù)LTR逆轉(zhuǎn)座子邊界與重復(fù)片段的結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)了檢測(cè)Bx7OE的STS標(biāo)記，可以準(zhǔn)確檢測(cè)Bx7OE是否存在[18]。

天津市農(nóng)作物研究所小麥中心，利用‘津強(qiáng)1號(hào)’(谷蛋白亞基為“2*、Bx7OE+By8、Dx5+Dy10亞基”)為母本[19]、‘濟(jì)麥22’(高分子量谷蛋白亞基為null、7+8、4+12亞基)為父本進(jìn)行人工雜交，用Bx7OE+8、5+10亞基替代‘濟(jì)麥22’的7+8、4+12亞基，并在F2代中篩選農(nóng)藝性狀傾向于‘濟(jì)麥22’的后代，并對(duì)F3代通過(guò)STS標(biāo)記對(duì)Bx7OE+8、5+10亞基進(jìn)行篩選，保留Bx7OE+8、5+10亞基，以‘津強(qiáng)1號(hào)/濟(jì)麥22’組合為模式，探討B(tài)x7OE+8、5+10亞基導(dǎo)入高產(chǎn)冬小麥品種，提升冬小麥品質(zhì)，為后續(xù)進(jìn)一步提升冬小麥品質(zhì)提供理論依據(jù)及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

春小麥‘津強(qiáng)1號(hào)’與冬小麥‘濟(jì)麥22’人工雜交的F3代，F(xiàn)1代種植于天津市農(nóng)作物研究所大棚，F(xiàn)2代種植于天津市農(nóng)作物有研究所云南元謀南繁基地，F(xiàn)3代為籽粒，水培萌發(fā)于天津市農(nóng)作物研究所人工氣候培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)方法

F2代單穗收獲種子，每穗種子中隨機(jī)挑選3粒種子，25 ℃,12 h光照，12 h黑暗培養(yǎng)，萌發(fā)至一心一葉期，將3粒種子萌發(fā)的葉片混合取樣于2 mL 離心管中，液氮研磨，加入600 μL CTAB，65 ℃提取40 min，期間每10 min顛倒混勻1次；加入600 μL 氯仿，上下顛倒混勻 10 min，12 000 r/min 離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，并加入等體積的異丙醇，輕柔混勻， -20 ℃冷卻2 h，4 ℃離心，12 000 r/min，離心 10 min，棄上清，加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，4 ℃， 12 000 r/min，離心10 min，通風(fēng)櫥內(nèi)過(guò)夜干燥，加入100 μL ddH2O，溶解DNA，-20 ℃保存。

使用2×TaqPCR Mastermix(KT201，北京，天根生化科技)，Bx7OESTS標(biāo)記[20]及Dx5 STS標(biāo)記[21]檢測(cè)群體的優(yōu)質(zhì)亞基。使用10 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中DNA模板50 ng，正反向引物各1 μL，2×TaqPCR Mastermix 5 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR程序?yàn)轭A(yù)變性 94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火58 ℃，延伸72 ℃ ，1 min，30個(gè)循環(huán)；大延伸72 ℃,5 min。15 g/L瓊脂糖，120 V，電泳40 min。

采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Powermarker[22]對(duì)標(biāo)記類(lèi)群進(jìn)行劃分。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bx7OE分析

對(duì)篩選農(nóng)藝性狀較好且接近‘濟(jì)麥22’的F2代，進(jìn)行單穗收獲，得到59份F3代，利用Bx7OE亞基產(chǎn)生機(jī)制所在的轉(zhuǎn)座子STS標(biāo)記(TaBACl215C06-F2467和TaBACl215C06- R25515)檢測(cè)59個(gè)F3代材料，33個(gè)材料中檢測(cè)到了Bx7OE亞基(圖1)，占檢測(cè)群體的55.93%，說(shuō)明Bx7OE亞基導(dǎo)入冬麥的比例較高。

2.2 Dx5分析

利用編碼Dx5亞基基因的STS標(biāo)記(5′-CGTCCCTATAAAAGCCTAGC-3′和5′-AGTATGAAACCTGCTGCGGAC-3′)對(duì)上述59個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，在41個(gè)樣本中檢測(cè)到Dx5亞基(圖2)，占總檢測(cè)樣本的69.49%，Dx5亞基導(dǎo)入冬麥的比例高于Bx7OE亞基。

2.3 Bx7OE亞基及Dx5亞基導(dǎo)入比例分析

在59個(gè)檢測(cè)樣本中，33份樣本存在Bx7OE亞基，41份樣本存在Dx5亞基，上述樣本中的27份樣本既存在Bx7OE亞基也存在Dx5亞基，占總測(cè)試樣本的45.76%。同時(shí)，存在12個(gè)樣本檢測(cè)不到Bx7OE亞基及Dx5亞基的標(biāo)記(圖3)。說(shuō)明Bx7OE亞基及Dx5亞基同時(shí)導(dǎo)入‘濟(jì)麥22’的比例較高。

2.4 籽粒性狀及優(yōu)質(zhì)亞基聯(lián)合篩選

在育種實(shí)踐中，農(nóng)民及面粉企業(yè)更傾向于種植及收購(gòu)籽粒為“白色”的小麥種子及原糧，即“白粒”小麥品種。因此，F(xiàn)3代材料中以籽粒顏色進(jìn)行了后代篩選，重點(diǎn)專(zhuān)注于“白?！焙蟠?，結(jié)合Bx7OE亞基及Dx5亞基分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)僅9個(gè)受檢材料籽粒為“白粒”，在9個(gè)白粒材料中，V21、V27、V29中既含有Bx7OE亞基又含有Dx5亞基，V24僅含有Bx7OE亞基，V22、V25、V28、V30中僅含有Dx5亞基，V23中不含Bx7OE亞基和Dx5亞基(圖4)。

2.5 小麥籽粒顏色及Bx7OE亞基和Dx5亞基編碼基因的遺傳特性

通過(guò)對(duì)F1代籽粒顏色調(diào)查發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代均表現(xiàn)為紅色籽粒。說(shuō)明‘津強(qiáng)1號(hào)’的籽粒顏色紅色為顯性性狀，‘濟(jì)麥22’的白色籽粒為隱性性狀，因此，在F3代中，紅色籽粒顯著高于白色籽粒。

通過(guò)對(duì)Bx7OE亞基、Dx5亞基編碼基因的序列比對(duì)分析，編碼這兩個(gè)基因的座位位于小麥第1同源群的B、D染色體上(圖5)，與已知的小麥控制籽粒顏色的基因不在同一個(gè)同源群上，獨(dú)立分離。

3 討論與結(jié)論

編碼高分子量谷蛋白的基因位于小麥基因組的第一同源群的A、B、D染色體長(zhǎng)臂上，由復(fù)等位基因控制，兩個(gè)基因在同一條染色體上連鎖遺傳[23]。在普通小麥的基因組上，編碼HMW-GS的基因分別位于Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)編碼兩個(gè)HMW-GS的亞基，按照分子量大小分為x、y亞基。其中x亞基分子量較大，y亞基分子量較小[24]。由于小麥中存在基因沉默現(xiàn)象，在大部分栽培小麥中Glu-A1y通常處于沉默狀態(tài)[25]，Glu-B1y有時(shí)也不能表達(dá)。在普通栽培小麥種中只有4個(gè)或者5個(gè)HMW-GS亞基表達(dá)。且Dx5與Dy10連鎖，Dx5與Dy10共同存在，因此僅檢測(cè)Dx5就可以代表這個(gè)基因座位的導(dǎo)入情況。但是由于Bx7OE位于小麥B組染色體上，而Dx5+Dy10位于小麥D組染色體上(圖5)，因此Bx7OE和Dx5+Dy10不連鎖，存在分離現(xiàn)象(圖4)。

59個(gè)F3代材料的分子標(biāo)記研究結(jié)果顯示，在33個(gè)F3代材料中檢測(cè)到了Bx7OE亞基(圖1)，占檢測(cè)群體的55.93%，在41個(gè)樣本中檢測(cè)到Dx5亞基(圖2)，占總檢測(cè)樣本的69.49%，上述樣品中有27份材料既存在Bx7OE亞基也存在Dx5亞基，占總測(cè)試樣品的45.76%(圖3)。結(jié)合59個(gè)與‘濟(jì)麥22’農(nóng)藝性狀接近的受檢材料，說(shuō)明Bx7OE和Dx5+Dy10導(dǎo)入‘濟(jì)麥22’的比例較高，但是STS分子標(biāo)記為基因序列檢測(cè)，只要序列存在即可檢出，不能區(qū)分純合子與雜合子，因此雖然導(dǎo)入比例加較高，但是并不能確定材料中Bx7OE和Dx5+Dy10亞基所在座位是否純合。這27個(gè)材料可能存在大量的雜合子，需要后續(xù)進(jìn)行分子標(biāo)記跟蹤及蛋白SDS-PAGE檢測(cè)Bx7OE和 Dx5+Dy10的表達(dá)情況。

研究表明小麥籽粒紅色為顯性性狀，白色為隱性性狀[26]，在經(jīng)過(guò)F2代農(nóng)藝性狀篩選的59個(gè)F3代株系中，僅9個(gè)純系白色籽粒性狀，說(shuō)明‘津強(qiáng)1號(hào)’籽粒紅色性狀對(duì)‘濟(jì)麥22’籽粒白色性狀也顯性，與其他品種的研究結(jié)果吻合。同時(shí)，研究表明部分品種籽粒紅色性狀受一對(duì)等位基因控制，F(xiàn)2呈現(xiàn)紅白粒3∶1分離[26]，部分品種籽粒紅色性狀受二對(duì)等位基因控制，F(xiàn)2代呈現(xiàn)15∶1[26]，二者均呈現(xiàn)籽粒紅色顯著多于籽粒白色性狀，F(xiàn)3代中白色籽粒將顯著低于紅色籽粒，因此F3代受檢的59份樣本中，白色籽粒顯著少于紅色籽粒，但是白色籽粒為純合性狀，后代不會(huì)出現(xiàn)分離現(xiàn)象。因此可以重點(diǎn)保留籽粒白色、含有Bx7OE+8、5+10亞基的材料。

農(nóng)藝性狀初步觀(guān)察及染色體遺傳特性分析發(fā)現(xiàn)，雖然‘津強(qiáng)1號(hào)/濟(jì)麥22’后代篩選了農(nóng)藝性狀傾向于‘濟(jì)麥22’的材料，但由于1/2的‘津強(qiáng)1號(hào)’染色體的滲入，導(dǎo)致后代不能完全保留‘濟(jì)麥22’的優(yōu)異性狀， Bx7OE+8、5+10亞基所在基因座位位于兩個(gè)同源群，因此應(yīng)在F3代中篩選農(nóng)藝性狀偏向于‘濟(jì)麥22’的材料與‘濟(jì)麥22’進(jìn)行回交，確保Bx7OE+8、5+10亞基導(dǎo)入后保持‘濟(jì)麥22’的其他優(yōu)異性狀。