孫正祥，孟祥佳，龍欣鈺，邱美莎，毛國慶，周燚

1.長江大學農(nóng)學院,湖北 荊州 434025 2.湖北省農(nóng)林病蟲害預警與調(diào)控工程技術研究中心(長江大學)，湖北 荊州 434025

由尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染引起的西瓜枯萎病是一種土傳的系統(tǒng)性病害，是西瓜的重要病害之一，在西瓜的整個生育期均可發(fā)生，對西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成巨大的威脅[1]。目前西瓜枯萎病的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治、抗病育種和化學藥品防治，其中化學防治因其效果好、成本低而成為了主要的病害防治手段[2,3]。但長期使用同一種農(nóng)藥易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且其大量殘留會殺死土壤中的有益微生物，同時對人類健康構(gòu)成威脅，不宜長期使用[3-5]。生防菌劑防治因其具有對植物病害的良好防效和對環(huán)境無污染等特點，逐漸受到了人們的重視[6-8]。

生防細菌具有適應環(huán)境能力強、營養(yǎng)需求簡單、定殖能力強等優(yōu)點，成為植物病害生物防治研究的熱點。目前，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和假單胞菌屬 (Pseudomonassp.)已成功應用于植物病害生物防治領域。但伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)應用于生物防治的研究較少[9]。菌株YZU-S230是由長江大學植物與微生物互作研究室前期分離得到的一株生防細菌，經(jīng)鑒定為伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)，具有廣譜的抑菌活性且對水稻紋枯病具有良好的盆栽防效。該研究通過盆栽試驗測定了YZU-S230對西瓜枯萎病的盆栽防效和對西瓜植株的促生作用及其定殖動態(tài)，旨在為西瓜枯萎病的生物防治提供更多的菌源，也為后期探究生防細菌與病原菌、寄主的互作關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株包括西瓜枯萎病病菌(F.oxysporumf.sp.niveumFON)和伯克霍爾德氏菌YZU-S230和YZU-S230gfp(將pBBR1MCS2-Tac-EGFP質(zhì)粒導入YZU-S230，由長江大學植物與微生物互作研究室前期轉(zhuǎn)化完成)。供試西瓜為西農(nóng)八號，由西北農(nóng)林科技大學選育。供試培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 YZU-S230對西瓜枯萎病菌的抑菌作用

采用平板對峙法[10]，選取培養(yǎng)3d的西瓜枯萎病原菌菌餅(5mm)接種至PDA平板中央，在平板兩側(cè)距平板中央各2.5cm的地方平行劃線接種菌株YZU-S230，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每個處理3次重復，7d后測量各處理和對照(CK)的菌落直徑并計算抑菌率。

1.2.2 西瓜幼苗的培養(yǎng)

挑選健康的大小一致的西瓜種子,按常規(guī)方法進行表面消毒[11]，隨后將其放入含有濕棉花的培養(yǎng)皿中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待種子露白后將其播種至含有無菌基質(zhì)土的育苗盤中，待西瓜幼苗長出第3片真葉后將其移栽至裝有無菌基質(zhì)土的盆缽中，用于后續(xù)試驗處理[12]。

1.2.3 YZU-S230對西瓜植株的促生作用

將活化好的YZU-S230 接種到LB培養(yǎng)基中，28℃、130r/min 震蕩培養(yǎng)4d，用分光光度計將其濃度調(diào)至光密度D600nm=1.0。采用灌根法接種生防細菌，每株西瓜幼苗接種20mL，以接種等量的LB為對照，每處理3次重復，各有西瓜苗15株[13]。接種30d后記錄西瓜植株的株高、根長、葉綠體含量和鮮重等數(shù)據(jù)[13]。

1.2.4 YZU-S230對西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽試驗設置3個處理:①西瓜枯萎病菌(FON)+提前3d接種YZU-S230；②FON+同時接種YZU-S230；③FON+LB。

將西瓜枯萎病菌接種至PDB培養(yǎng)基中，于28℃、130r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)，5d后用血球計數(shù)板檢測培養(yǎng)液中西瓜枯萎病菌孢子的濃度，接種時將孢子液與無菌基質(zhì)土進行混合制成病土，使每克基質(zhì)土含有1.0×105cfu個分生孢子[15,16]。細菌的培養(yǎng)和接種參照1.2.1。以接種LB為對照，每處理 3次重復，各有西瓜苗15株。接種30d后調(diào)查各處理西瓜植株的發(fā)病嚴重度，計算相應的病情指數(shù)和相對防效[17]。

1.2.5 YZU-S230在西瓜根部的定殖動態(tài)

將活化后的菌株YZU-S230gfp接種至含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、130r/min震蕩培養(yǎng)，4d后用分光光度計將培養(yǎng)液濃度調(diào)至光密度D600=1.0，其接種方法參照1.2.1。分別在接種后1、3、5、7、9、15、21、30d采集西瓜苗，采用稀釋涂布法分離其根部內(nèi)生細菌[18]，取100μL 研磨液涂布于含卡那霉素的LB固體平板上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后對平板上的菌落進行計數(shù)，計算菌株在西瓜根部的定殖數(shù)量[19,20]。另取上述不同時間的西瓜苗根部組織，用無菌水沖洗干凈后在冷凍切片機上切成薄片，并將其制成玻片，于熒光顯微鏡下觀察菌株YZU-S230gfp在西瓜根部組織中的定殖動態(tài)[21]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對所獲得的數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 YZU-S230對西瓜枯萎病菌的抑菌作用

圖1 YZU-S230對西瓜枯萎病菌的抑菌作用Fig.1 Inhibition effect of YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt

平板對峙試驗表明,對照組西瓜枯萎病菌平均菌落直徑為81.84mm，處理組西瓜枯萎病菌平均菌落直徑為18.22mm(見圖1)。菌株YZU-S230對西瓜枯萎病的抑制率為82.80%。

2.2 YZU-S230對西瓜植株的促生作用

促生長試驗結(jié)果表明,經(jīng)YZU-S230處理后30d，西瓜植株的地上鮮重、主蔓長和根長都顯著大于對照組，其中地上鮮重與對照相比增加了6.9g，主蔓長和根長分別增加了8.7cm和3.0cm(表1)。

表1 菌株YZU-S230對西瓜的促生作用Table 1 Growth promotion of strain YZU-S230 on watermelon

2.3 YZU-S230對西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽防效試驗結(jié)果顯示，處理30d后，只接種病原菌時西瓜苗的發(fā)病率是100%，而用菌株YZU-S230處理后其發(fā)病率為60%，且接種生防菌的植株病情指數(shù)都顯著低于對照。此外，提前3d接種菌株YZU-S230時其對西瓜枯萎病的防效可達68.40%，明顯高于同時接種時的防效(30.87%)(表2、圖2)。

表2 YZU-S230對西瓜枯萎病的盆栽防效(接種30d后)Table 2 Control effect of strain YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment(30 days ofter inoculation)

2.4 YZU-S230在西瓜根部的定殖動態(tài)

圖2 菌株YZU-S230對西瓜枯萎病的盆栽防效Fig.2 Control effect of strain YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment

圖3 不同時間下YZU-S230在西瓜根部的定殖數(shù)量Fig.3 Colonization number of YZU-S230 in watermelon roots at different times

定殖試驗結(jié)果顯示，YZU-S230gfp不僅能在西瓜植株根表穩(wěn)定定殖，還能進入根內(nèi)定殖。該菌株在西瓜根部可持續(xù)定殖30d，其數(shù)量先增后減，隨后趨于穩(wěn)定，第21天時其定殖數(shù)量仍可達1.2×105cfu/g(見圖3)。鏡檢結(jié)果表明，YZU-S230gfp在熒光顯微鏡下能發(fā)出明顯的綠色熒光，在根組織中的數(shù)量也呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(見圖4)。

圖4 YZU-S230gfp在西瓜根部的定殖動態(tài)Fig.4 Colonization dynamics of YZU-S230gfp in watermelon roots

3 討論與結(jié)論

西瓜枯萎病是世界上十分嚴重的土傳病害之一，目前沒有安全有效的防治方法[22]。利用植物內(nèi)生細菌以及根際細菌抑制病原菌是生物防治的重要手段和方法。已有研究表明，植物內(nèi)生細菌與根際細菌具有促進植物種子萌發(fā)、增強植物抗病能力、促進植物幼苗生長的作用[23,24]。菌株YZU-S230是從白芨根部分離的一株內(nèi)生細菌，前期試驗表明該菌株對水稻紋枯病的盆栽防效顯著，而筆者的研究表明其對西瓜枯萎病具有良好的盆栽防效，對西瓜植株具有促生長作用。

生防菌在植物體內(nèi)的有效定殖是其發(fā)揮生防效果的重要條件之一，因此測定生防菌的定殖能力已成為目前研究生防菌作用機制的重要內(nèi)容[25]。研究采用抗生素標記法[25]檢測了菌株的定殖能力，結(jié)果顯示西瓜根部YZU-S230菌量在第3天出現(xiàn)高峰后迅速下降，這可能與西瓜在此時生長迅速有關，生物量迅速增加導致植株內(nèi)的YZU-S230菌量相對下降。21d后，菌株YZU-S230和植物苗的生長達到一個相對平穩(wěn)的狀態(tài)，此時單位鮮重植物組織中的YZU-S230菌量也達到一個相對穩(wěn)定狀態(tài)，表明菌株YZU-S230能與西瓜植株形成共生關系，可以在西瓜植株內(nèi)長期穩(wěn)定定殖并發(fā)揮防治西瓜枯萎病的作用[27]。

室內(nèi)環(huán)境與田間環(huán)境區(qū)別較大，導致菌株在田間試驗中的防治效果遠低于實驗室中的防治效果。菌株YZU-S230能否在田間穩(wěn)定發(fā)揮其生防機制還需通過下一步的田間試驗進行探究。其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性(溫度、紫外光)是該菌株能被制成生防菌活菌劑，并與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實際情況相結(jié)合的關鍵。因此，對菌株YZU-S230產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)的研究是后期工作的重點。