李 凈 倪姮佳* 黃勇剛 李 夢(mèng) 譚碧娥

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)基因組與種質(zhì)創(chuàng)新研究中心，長(zhǎng)沙 2410128；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與代謝過(guò)程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 2410125)

新生仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠成熟，斷奶前主要依賴于豬乳中母源抗體的保護(hù)[1]。斷奶后，由于飼喂環(huán)境及飲食的改變，細(xì)菌、病毒、真菌等病原微生物通過(guò)損傷免疫器官和細(xì)胞，干擾抗原呈遞，抑制或阻斷抗體的生成，導(dǎo)致仔豬抗病能力下降，引發(fā)免疫抑制[2-5]。免疫抑制仔豬的臨床癥狀為淋巴細(xì)胞(LYM)數(shù)量減少、活性下降，抗體生成減少，免疫器官發(fā)育不良等，表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、腹瀉嚴(yán)重及死亡率高[6-9]。因此，研究免疫抑制仔豬的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控對(duì)提高斷奶仔豬存活率、提高養(yǎng)殖效益具有重要意義。

鈣和磷是生物必需的元素，參與構(gòu)建骨骼、肌肉、神經(jīng)和體液等組織，參與神經(jīng)傳遞、肌肉收縮以及激素分泌等重要生理過(guò)程[10]。鈣離子作為第二信使參與了B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞間的信號(hào)傳遞[11]。磷也是代謝和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的重要元素，與鈣元素一起參與骨骼代謝和免疫調(diào)節(jié)[12]。當(dāng)仔豬處于非健康狀態(tài)時(shí)，機(jī)體對(duì)礦物元素的需要量與健康狀態(tài)時(shí)存在差異，因此，部分學(xué)者認(rèn)為適當(dāng)提高非健康仔豬的礦物元素供給有助于改善免疫系統(tǒng)功能，縮短病程[13-14]。另外，研究表明，補(bǔ)鈣可顯著緩解高脂飲食導(dǎo)致的結(jié)腸炎癥和免疫反應(yīng)[15]；提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度可顯著調(diào)高細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的功能[16]。因此，依據(jù)前人研究結(jié)果推測(cè)，適當(dāng)補(bǔ)鈣有助于提高機(jī)體的免疫功能，緩解免疫抑制對(duì)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育造成的影響，但目前缺乏相關(guān)的研究。

伊立替康(irinotecan，CPT)是一種治療癌癥的化療藥物，具有抑制機(jī)體免疫功能的副作用，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉[17-18]，目前，該藥物常用于建立動(dòng)物免疫抑制模型。研究表明，斷奶仔豬在1.5倍NRC標(biāo)準(zhǔn)的鈣水平飼糧飼喂下，料重比(F/G)最低，平均日增重(ADG)最高，生長(zhǎng)性能達(dá)到最優(yōu)[19]。在對(duì)仔豬沒(méi)有毒副作用的前提下，本研究想進(jìn)一步探討1.5倍NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)的鈣、磷對(duì)免疫的調(diào)控機(jī)制，擬通過(guò)腹腔注射CPT(注射劑量18 mg/kg BW)建立免疫抑制仔豬模型[20]，研究適當(dāng)提高飼糧鈣、磷水平(固定鈣∶磷為1.2∶對(duì)CPT所致免疫抑制仔豬生長(zhǎng)性能、血液生理生化指標(biāo)及礦物元素代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、分組和飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選取18頭2～4胎次22日齡的“杜長(zhǎng)大”三元雜交斷奶仔豬，公母各占1/2，隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、模型組和試驗(yàn)組，其中對(duì)照組和模型組的飼糧鈣、磷水平參考NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)組的飼糧鈣、磷水平為1.5倍NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，所有豬只單欄飼養(yǎng)。試驗(yàn)選用2種基礎(chǔ)飼糧(飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1)，分別用于試驗(yàn)Ⅰ期(第1～14天)和試驗(yàn)Ⅱ期(第15～28天)。試驗(yàn)第23天，模型組和試驗(yàn)組仔豬腹腔注射18 mg/kg BW CPT，連續(xù)注射4 d，對(duì)照組注射等量生理鹽水。試驗(yàn)期間所有豬只自由采食和飲水(以吃完后料槽內(nèi)有少量剩料為準(zhǔn))，每天飼喂3次(08：00、12：00和18：00)。飼喂期間觀察仔豬健康和腹瀉情況，記錄每日飼糧消耗量。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items22～35日齡 22 to 35 days of ageNRC (2012)1.5×NRC (2012)36～49日齡 36 to 49 days of ageNRC (2012)1.5×NRC (2012)L-色氨酸 L-Trp0.060.060.050.05預(yù)混料 Premix2)0.500.500.500.50合計(jì) Total100.00100.00100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels3)消化能 DE/(MJ/kg)14.4113.7014.4213.78代謝能 ME/(MJ/kg)14.2513.5514.3213.67粗蛋白質(zhì) CP 17.9417.8917.6417.46粗脂肪 EE3.103.524.194.70鈣 Ca0.811.190.721.07總磷 TP0.691.000.570.84有效磷 AP0.490.800.360.64

1.2 樣本采集

試驗(yàn)第29天，對(duì)禁食12 h的仔豬進(jìn)行屠宰采樣。采集前腔靜脈血液，一部分置于5 mL乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，用于測(cè)定血常規(guī)和血漿生化指標(biāo)；另一部分置于普通采血管中，靜置15 min后，1 237×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存，用于血清微量元素含量的測(cè)定。仔豬放血處死后取出肝臟、腎臟和結(jié)腸食糜，并于-20 ℃保存，用于鈣、磷、銅、鐵和錳含量的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生長(zhǎng)性能和腹瀉指數(shù)

記錄仔豬每天的采食量，于試驗(yàn)第1、15和29天早上對(duì)仔豬進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算試驗(yàn)Ⅰ期、試驗(yàn)Ⅱ期和全期的ADG、平均日采食量(ADFI)和F/G。

試驗(yàn)期間觀察并記錄每頭仔豬每天的腹瀉情況，依據(jù)腹瀉狀況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[21]，不腹瀉為0分，輕度腹瀉為1分，中度腹瀉為2分，重度腹瀉為3分，分別計(jì)算試驗(yàn)Ⅰ期、試驗(yàn)Ⅱ期和全期的腹瀉指數(shù)，計(jì)算公式如下：

腹瀉指數(shù)=每頭仔豬腹瀉評(píng)分之和/
該頭仔豬飼養(yǎng)天數(shù)。

1.3.2 血常規(guī)指標(biāo)

使用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(BC-5000VET，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定血液中各類常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(NEU)、LYM、單核細(xì)胞(MON)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BAS)及紅細(xì)胞(RBC)數(shù)量、血紅蛋白(HGB)含量、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)、血小板(PLT)數(shù)量、平均血小板體積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)以及血小板壓積(PCT)等。

1.3.3 血漿生化指標(biāo)

使用全自動(dòng)生化分析儀(Cobas c311，羅氏公司)測(cè)定仔豬血漿中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、補(bǔ)體4(C4)、免疫球蛋白M(IgM)的含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性等。測(cè)定方法參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書。

1.3.4 肝臟、腎臟、結(jié)腸上段食糜和血清中鈣、磷、銅、鐵和錳的含量

取15.0 g左右肝臟、腎臟和結(jié)腸上段食糜冷凍干燥并粉碎。稱取0.20 g粉碎樣品或0.5 mL血清置于微波消解罐中，依次加入10 mL濃硝酸和1 mL過(guò)氧化氫，使用微波消解儀進(jìn)行消煮，消煮結(jié)束后在消解罐中再加入0.5 mL高氯酸，180 ℃趕酸2 h。最后，用1%硝酸定容至10 mL，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Agilent 5110 ICP-OES)檢測(cè)樣品中鈣、磷、銅、鐵和錳的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

仔豬免疫抑制模型評(píng)估采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)(student’st-test)，其余試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以平均值(mean)和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬免疫抑制模型的建立

以腹瀉指數(shù)和血液免疫細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)，對(duì)本研究建立的免疫抑制仔豬模型進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如圖1所示，建模后(試驗(yàn)第23～28天)，與對(duì)照組相比，模型組仔豬血液中WBC、NEU、LYM、MON和EOS的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，腹瀉指數(shù)顯著升高(P<0.05)，表明本試驗(yàn)的免疫抑制仔豬模型建立成功。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2.2 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉指數(shù)的影響

鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉指數(shù)的影響結(jié)果如表2所示。試驗(yàn)Ⅰ期，各組間仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅱ期，與對(duì)照組相比，模型組仔豬ADG顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)/G和腹瀉指數(shù)顯著升高(P<0.05)；而與模型組相比，試驗(yàn)組仔豬ADG有升高趨勢(shì)(P>0.05)，F(xiàn)/G有降低趨勢(shì)(P>0.05)，腹瀉指數(shù)顯著降低(P<0.05)。試驗(yàn)全期，對(duì)照組仔豬ADG顯著高于其他2組(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著低于其他2組(P<0.05)。

表2 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉指數(shù)的影響

2.3 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬血常規(guī)指標(biāo)的影響

鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬血常規(guī)指標(biāo)的影響結(jié)果如表3所示。與對(duì)照組相比，模型組和試驗(yàn)組仔豬血液中WBC、NEU、LYM和EOS的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，模型組仔豬血液中MON的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，血液中HGB的含量顯著升高(P<0.05)；而與模型組相比，試驗(yàn)組仔豬血液中MON的數(shù)量有升高趨勢(shì)(P>0.05)，血液中HGB的含量有降低趨勢(shì)(P>0.05)。

表3 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬血常規(guī)指標(biāo)的影響

續(xù)表3項(xiàng)目 Items對(duì)照組Control group模型組Model group試驗(yàn)組Experimental groupSEMP值P-value血小板 PLT/(×109個(gè)/L)310.20278.17262.5029.6980.829平均血小板體積 MPV/fL9.789.7710.220.1570.430血小板體積分布寬度 PDW/%15.2615.1815.250.0900.939血小板壓積 PCT/%0.300.270.260.0270.875

2.4 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬血漿生化指標(biāo)的影響

鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬血漿生化指標(biāo)的影響結(jié)果如表4所示。與對(duì)照組相比，模型組和試驗(yàn)組仔豬血漿中TP的含量顯著升高(P<0.05)，模型組和試驗(yàn)組仔豬血漿中TP的含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬血漿生化指標(biāo)的影響

2.5 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬肝臟、腎臟、血清和結(jié)腸食糜中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響

飼糧添加高鈣、高磷對(duì)免疫抑制仔豬肝臟、腎臟、血清和結(jié)腸食糜中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響結(jié)果如表5～表8所示。與對(duì)照組相比，模型組和試驗(yàn)組仔豬血清中銅的含量顯著升高(P<0.05)(表5)，結(jié)腸上段食糜中銅、鐵的含量顯著降低(P<0.05)(表6)。與對(duì)照組和模型組相比，試驗(yàn)組仔豬肝臟中磷的含量顯著升高(P<0.05)(表7)。飼糧添加高鈣、高磷對(duì)免疫抑制仔豬腎臟中鈣、磷、銅、鐵和錳的含量無(wú)顯著影響(P>0.05)(表8)。

表5 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬血清中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響

表6 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬結(jié)腸上段食糜中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響

表7 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬肝臟中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響

表8 鈣、磷對(duì)免疫抑制仔豬腎臟中鈣、磷、銅、鐵、錳含量的影響

3 討 論

當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫抑制時(shí)，動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。研究發(fā)現(xiàn)，母豬采食脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染的飼糧，會(huì)產(chǎn)生免疫抑制，并且使得ADFI顯著降低，生長(zhǎng)速度減慢[7]；給BALB/C小鼠腹腔注射100 mg/kg CPT會(huì)引發(fā)小鼠延遲性腹瀉[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，CPT嚴(yán)重影響了斷奶仔豬的生長(zhǎng)，并導(dǎo)致了腹瀉，而提高飼糧的鈣、磷水平可顯著降低免疫抑制仔豬的腹瀉指數(shù)，有助于提高仔豬的ADG，這一現(xiàn)象可能與膳食鈣對(duì)腸道健康的調(diào)控有關(guān)。Zhang等[23]比較不同水平丙酸鈣對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)鈣可以改善犢牛的ADG和飼料轉(zhuǎn)換率。此外，研究表明，高鈣飼糧可以通過(guò)緩解腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)對(duì)腸黏的刺激，抑制腸道通透性的增加，最終緩解腹瀉[24]。

血液中WBC的數(shù)量與體內(nèi)的免疫反應(yīng)有關(guān)。其中，NEU比例升高可能為細(xì)菌感染[25]，LYM比例發(fā)生變化可能與病毒感染有關(guān)[26]。研究表明，鈣離子可調(diào)控LYM的功能，并作為第二信使參與了免疫細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，提高飼糧鈣、磷水平有助于提高免疫抑制仔豬血液中MON的數(shù)量，該現(xiàn)象可能與鈣對(duì)MON功能的調(diào)控有關(guān)。因?yàn)殁}可通過(guò)作用于MON的鈣敏感受體，促進(jìn)MON的聚集，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)和體外的先天免疫應(yīng)答[29]。當(dāng)機(jī)體免疫功能受阻時(shí)，血液生化指標(biāo)也會(huì)產(chǎn)生變化[30]。例如嘔吐、腹瀉、高熱和休克等可導(dǎo)致血漿因水分喪失而濃縮，使得血漿蛋白含量相對(duì)性升高[31]。本研究中，免疫抑制仔豬的血漿TP含量升高可能與免疫抑制仔豬的嚴(yán)重腹瀉有關(guān)。

雖然補(bǔ)充礦物元素對(duì)機(jī)體健康有諸多好處，但其對(duì)免疫功能的調(diào)控具有兩面性。缺乏或過(guò)量均會(huì)導(dǎo)致免疫抑制，并且補(bǔ)充過(guò)高劑量的鈣、磷還會(huì)影響其他微量元素的吸收和代謝[32]。因此，為了探討本試驗(yàn)所使用的鈣、磷水平是否影響了微量元素的代謝，我們對(duì)仔豬臟器和結(jié)腸食糜中的礦物元素含量進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫抑制仔豬飼喂1.5倍NRC(2012)水平的鈣、磷后，肝臟中的微量元素含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而肝臟是機(jī)體儲(chǔ)存微量元素的主要器官，這表明本試驗(yàn)所用的鈣、磷劑量對(duì)機(jī)體的微量元素代謝無(wú)顯著影響。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制仔豬結(jié)腸食糜中銅的含量顯著降低，血清中銅的含量顯著升高，表明免疫抑制仔豬會(huì)提高對(duì)銅的利用率。銅是參與免疫反應(yīng)的關(guān)鍵元素，病畜適當(dāng)補(bǔ)充銅元素有助于提高機(jī)體的免疫功能，恢復(fù)正常的生理功能[33]。因此，本研究中仔豬的銅利用率升高可能是機(jī)體在免疫抑制狀態(tài)下的一種反饋調(diào)節(jié)，促進(jìn)了仔豬免疫功能的恢復(fù)。

4 結(jié) 論

① 仔豬腹腔注射CPT可引起仔豬腹瀉，嚴(yán)重影響仔豬的生長(zhǎng)性能，降低仔豬血液中免疫細(xì)胞的數(shù)量，據(jù)此建立仔豬免疫抑制模型。

② 飼糧補(bǔ)充1.5倍NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)的鈣、磷可有效緩解CPT所致免疫抑制對(duì)仔豬生長(zhǎng)的影響，減少腹瀉，有助于恢復(fù)血液中MON的數(shù)量，并且不會(huì)干擾其他微量元素的代謝。