王洪偉 林娟

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 ?？?570311)

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，手術(shù)、放療、化療是目前主要治療方式，雖取得一定效果，但對(duì)于晚期和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者尚未有令人滿意的治療手段，因此探索和發(fā)展更有效的治療方式有重要意義〔1〕。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向治療成為癌癥治療新方法，能提高療效、減少毒副作用〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，廣泛參與轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，有望成為宮頸癌診斷的新標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn)〔3〕。研究表明在胃癌組織和細(xì)胞中miR-411-5p低表達(dá)，過表達(dá)miR-411-5p抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔4〕。miR-411-5p過表達(dá)可降低黑色素瘤細(xì)胞A375增殖及侵襲能力，同時(shí)可降低癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)侵襲能力〔5〕。鞘氨醇激酶(SPHK)1是一種致癌激酶，其在多種惡性腫瘤中上調(diào)表達(dá)，并與其進(jìn)展相關(guān)〔6〕。干擾SPHK1基因表達(dá)可有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。宮頸癌組織中SPHK1的表達(dá)顯著增加，與腫瘤大小、侵襲深度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴血管侵襲顯著相關(guān)〔8〕。且還有研究發(fā)現(xiàn)miR-411在宮頸癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，miR-411的低表達(dá)與腫瘤大小、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，可通過直接靶向STAT3抑制宮頸癌的進(jìn)展〔9〕。但miR-411-5p對(duì)宮頸癌存活和凋亡的影響及其分子機(jī)制是否與SPHK1有關(guān)尚未清楚。本研究探討miR-411-5p是否通過SPHK1影響宮頸癌的存活和凋亡。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 正常宮頸細(xì)胞株Ect1/E6E7和宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa、C33a、Caski購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol、熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司、二辛可寧酸(BCA)試劑盒、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司。電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像儀、酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)FACS caliber公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 正常宮頸細(xì)胞株Ect1/E6E7和宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa、C33a、Caski用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液1次，待細(xì)胞融和至80%左右時(shí)，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞SiHa培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，將miR-con、miR-411-5p、anti-miR-con、anti-miR-411-5p、si-con、si-SPHK1分別轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞中，分別記為miR-con組、miR-411-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-411-5p組、si-con組、si-SPHK1組；將miR-411-5p質(zhì)粒分別與pcDNA、pcDNA-SPHK1共轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞中，分別記為miR-411-5p+pcDNA組、miR-411-5p+pcDNA-SPHK1組。轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)miR-411-5p表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，miR-411-5p以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-411-5p上游引物：5′-TCGCTGTAGTAGACCGTAT-3′，下游引物：5′-GCACCTCAGGCTTGTACC-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGCAGCACATATACTAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.4Western印跡檢測(cè)SPHK1、細(xì)胞核增殖抗原標(biāo)志物(Ki67)、細(xì)胞周期素(Cyclin)D1、酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、酶切caspase-9表達(dá)水平 提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。測(cè)濃度后上樣，電泳90 min轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉90 min后加入一抗4℃孵育過夜；TBST洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗滌3次，每次5～10 min，顯影，定影，用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)各條帶吸光度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)，分別加入5 mg/ml MTT 10 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；1 000 r/min離心10 min，吸棄培養(yǎng)液，每孔加 150 μl的DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。然后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD)值。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，1 000 r/min離心5 min，吸去培養(yǎng)液用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，加入Annexin V-FITC和PI，37℃避光反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)560 nm處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-411-5p對(duì)SPHK1的靶向調(diào)控 構(gòu)建SPHK1的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-SPHK1和MUT-SPHK1，用LipofectamineTM2000將WT-SPHK1和MUT-SPHK1分別與miR-con和miR-411-5p共轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞中。按照說(shuō)明書操作進(jìn)行，檢測(cè)熒光活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞中miR-411-5p和SPHK1的表達(dá) 與正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7相比，宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa、C33a、Caski中miR-411-5p表達(dá)水平顯著降低，SPHK1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞中SPHK1蛋白的表達(dá)

表1 宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞中miR-411-5p和SPHK1的表達(dá)

2.2轉(zhuǎn)染miR-411-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞存活的影響 與miR-con組相比，miR-411-5p組宮頸癌SiHa細(xì)胞中Ki67、CyclinD1表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)，見圖2，表2?？梢?，miR-411-5p過表達(dá)抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞存活。

圖2 宮頸癌SiHa細(xì)胞Ki67和CyclinD1蛋白表達(dá)

表2 轉(zhuǎn)染miR-411-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞存活的影響

2.3轉(zhuǎn)染miR-411-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響 與miR-con組相比，miR-411-5p組宮頸癌SiHa細(xì)胞中酶切caspase-3、酶切caspase-9表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表3，圖3。可見，miR-411-5p過表達(dá)促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡。

表3 轉(zhuǎn)染 miR-411-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響

圖3 宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白表達(dá)

2.4miR-411-5p靶向調(diào)控SPHK1的表達(dá) 通過targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到SPHK1與 miR-411-5p存在結(jié)合位點(diǎn)見圖4A。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型和突變型SPHK1基因表達(dá)載體WT-SPHK1和MUT-SPHK1后，相較于miR-con組，miR-411-5p組WT-SPHK1細(xì)胞SiHa的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而MUT-SPHK1細(xì)胞SiHa的熒光素酶活性差異不顯著。見表4。Western檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于miR-con組SPHK1表達(dá)水平(0.68±0.08)，miR-411-5p組(0.19±0.36)顯著降低；相較于anti-miR-con組SPHK1表達(dá)水平(0.71±0.08)，anti-miR-411-5p 組(1.25±0.11)顯著升高(P<0.05)。見圖4B。可見，miR-411-5p可靶向調(diào)控SPHK1的表達(dá)。

1～4：miR-con組、miR-411-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-411-5p組圖4 miR-411-5p與SPHK1存在的互補(bǔ)核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5沉默SPHK1對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的存活和細(xì)胞凋亡的作用 與si-con組相比，si-SPHK1組宮頸癌SiHa細(xì)胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表達(dá)水平顯著降低，酶切caspase-3、酶切caspase-9表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低；細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)，見圖5、表5?？梢?，沉默SPHK1抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.6過表達(dá)SPHK1部分逆轉(zhuǎn)miR-411-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡的作用 與miR-con組相比，miR-411-5p 組宮頸癌細(xì)胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表達(dá)水平顯著降低，酶切caspase-3、酶切caspase-9表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低；細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與miR-411-5p +pcDNA組相比，miR-411-5p+pcDNA-SPHK1組宮頸癌細(xì)胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表達(dá)水平顯著升高，酶切caspase-3、酶切caspase-9表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著升高；細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6，表6?？梢?，過表達(dá)SPHK1部分逆轉(zhuǎn)miR-411-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活抑制和凋亡促進(jìn)作用。

圖5 沉默SPHK1對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡和各蛋白表達(dá)的影響

表5 沉默SPHK1抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞存活和誘導(dǎo)凋亡的作用

1～4:miR-con組、miR-411-5p組、miR-411-5p+pcDNA組、miR-411-5p+pcDNASPHK1組圖6 過表達(dá)SPHK1對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡和各蛋白表達(dá)的影響

表6 過表達(dá)SPHK1和轉(zhuǎn)染miR-411-5p表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，闡明宮頸癌發(fā)病相關(guān)RNA分子機(jī)制，可為宮頸癌的診斷和治療提供新思路〔10〕。miRNA在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能〔11〕。研究顯示miR-411-5p通過靶向GRB2抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔12〕。miR-411通過靶向ZnT1抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔13〕。miR-411-5p通過靶向PUM1抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明過表達(dá)miR-411-5p抑制宮頸癌細(xì)胞存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期G期的關(guān)鍵調(diào)控因子，其過量表達(dá)可使細(xì)胞增殖失調(diào)而促進(jìn)癌變。Ki-67是細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原，是反映細(xì)胞增殖的指標(biāo)〔15〕。caspase-9活化可以激活caspase-3，而caspase-9和caspase-3活化裂解為酶切caspase-3和酶切caspase-9，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔16〕。進(jìn)一步說(shuō)明過表達(dá)miR-411-5p抑制宮頸癌細(xì)胞存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。SPHK1與腫瘤細(xì)胞的存活、侵襲、遷移密切相關(guān)。有研究報(bào)道抑制SPHK1能引起細(xì)胞G1期阻滯及降低細(xì)胞侵襲能力〔17〕；抑制SPHK1可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡〔18〕。子宮內(nèi)膜癌中SPHK1表達(dá)升高，其可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展〔19〕。本研究結(jié)果說(shuō)明沉默SPHK1可抑制抑制宮頸癌細(xì)胞存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與前人對(duì)SPHK1作用研究的結(jié)果相符。研究顯示miR-506可通過靶向SPHK1抑制肝癌血管生成〔20〕。本研究結(jié)果提示miR-411-5p可能通過調(diào)控SPHK1影響宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡。