賴(lài) 晶，史中飛，宋平順，王子夏，倪 琳，滕寶霞

(甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730013)

在2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）中規(guī)定柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.和狹葉柴胡B.scorzonerifolium Wild.的干燥根，根據(jù)性狀不同，前者習(xí)稱(chēng)“北柴胡”，后者習(xí)稱(chēng)“南柴胡”[1]。柴胡作為大宗中藥材，有疏肝、升陽(yáng)的功能，有保肝、解熱、抗腫瘤等藥效。根據(jù)《中國(guó)植物志》記載，我國(guó)柴胡屬有36 種，17 變種，7 變型[2]。柴胡屬植物不僅種類(lèi)較多，分布廣泛，不同產(chǎn)地均有作為柴胡藥用的習(xí)性，而且性狀特征較為相似，使得采集和使用時(shí)難以鑒別，以致出現(xiàn)混偽品與正品柴胡的混用現(xiàn)象。藏柴胡作為柴胡屬變種之一，其來(lái)源于傘形科植物窄竹葉柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var.stenophyllum（Wolf）Shan et Y. Li 的干燥根，主產(chǎn)于云南、四川、貴州、西藏等部分地區(qū)[3]。藏柴胡價(jià)格低，常作為北柴胡摻偽藥材之一，因此建立快速、穩(wěn)定鑒別藏柴胡的方法尤為重要。DNA 分子指紋圖譜作為中藥材鑒別的方法之一，具有微觀(guān)或化學(xué)成分所無(wú)法達(dá)到的特異性。本實(shí)驗(yàn)基于ITS 通用引物對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序，用DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序序列及NCBI 中部分序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)藏柴胡的SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)鑒別引物并對(duì)特異性PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而建立一種快速、穩(wěn)定鑒別北柴胡中摻偽藏柴胡的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

VeritiTM 96-Well 型PCR 儀、Legend Micro 21R型高速冷凍離心機(jī)、Nano Drop2000 型微量核酸定量?jī)x（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Sub Cell? GT 型電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；Geldoc-It2 315 型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP 公司）。

1.2 藥材與試劑

柴 胡 標(biāo) 準(zhǔn) 藥 材（ 北 柴 胡， 批 號(hào)：120992-201509）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。收集15 份樣品（北柴胡10 份、藏柴胡5 份），經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順檢驗(yàn)師鑒定。Plant Genomic DNA Kit 200 preps 植物基因組DNA 提取試劑盒，D2000 DNA Marker ，2 × Taq PCR MasterMix，2 × Taq Plus PCR Mix，50 × TAE [天根生化科技（北京）有限公司]；2 × Taq PCR StarMix（北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司）；瓊脂糖（美國(guó)Invitrogen 公司）；GelRed （美國(guó)Biotium 公司）。樣品信息見(jiàn)表1。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 的提取 取適量樣品粉碎，采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取樣品總DNA，調(diào)整質(zhì)量濃度于5 ng/μL，作為供試品DNA 模板，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ITS 片段擴(kuò)增與測(cè)序 各樣品采用ITS 通 用 引 物 進(jìn) 行 擴(kuò) 增[4]，ITS5（F）: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；ITS 4（R）:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR 反 應(yīng) 體 系總體積為20 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 10 μL，正反引物各1 μL，DNA 模板5 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，35 個(gè)循環(huán)（ 94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min），72 ℃ 5 min。產(chǎn)物由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司測(cè)序，各樣品均采用正反雙向測(cè)序，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 樣品信息Tab. 1 Information of samples

1.3.3 位點(diǎn)特異性鑒別引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI 中查找的北柴胡和藏柴胡ITS 序列用DNAMAN 軟件進(jìn)行比對(duì)分析。用Premier Primer 5.0 軟件針對(duì)藏柴胡的特異性變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性鑒別引物，由北京華大基因生物公司合成。引物序列為BmF：5'-GCTCCTCGGCCCAAATAT-3'，BmR：5'-GATGGCAAGAGGTTAGTAGT-3'。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化 用1、2、10、11、12 號(hào)樣品對(duì)特異性鑒別引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，為獲得最適特異性PCR 反應(yīng)條件，分別考查退火溫度（59、61、63、65、67 ℃）、不同引物量（0.2、0.3、0.4 μL）、循環(huán)數(shù)（25、30、35 個(gè)循環(huán)）、不同酶（2 ×Taq Plus PCR Mix、2×Taq PCR StarMix）對(duì)PCR 擴(kuò)增的影響。

1.3.5 電泳 用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，在130 V 電壓的條件下電泳約50 min，然后利用凝膠成像分析儀拍照。

2 結(jié)果分析

2.1 退火溫度的考查

分別對(duì)59、61、63、65、67℃ 5 個(gè)退火溫度進(jìn)行考查。退火溫度為59、61℃時(shí)，有假陽(yáng)性條帶出現(xiàn)；退火溫度上升至63、65℃時(shí)，藏柴胡有清晰的特異性擴(kuò)增條帶，北柴胡則無(wú)條帶；退火溫度升高至67℃時(shí)，藏柴胡與北柴胡均未擴(kuò)增出條帶。為保證PCR 有良好的重復(fù)性，采用65℃作為此方法的退火溫度，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同退火溫度下PCR 電泳圖Fig. 1 PCR electrophoresis of different annealing temperatures

2.2 循環(huán)參數(shù)的考查

分別對(duì)25、30、35 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)進(jìn)行考查。25、35 個(gè)循環(huán)時(shí)，藏柴胡有清晰的特異性擴(kuò)增條帶，且無(wú)假陽(yáng)性條帶；35 個(gè)循環(huán)時(shí)，出現(xiàn)假陽(yáng)性條帶。為保證擴(kuò)增的穩(wěn)定性及區(qū)分度，選擇30 個(gè)循環(huán)作為擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同循環(huán)數(shù)PCR 電泳圖Fig. 2 PCR electrophoresis of different cycles

2.3 不同引物量的考查

分別對(duì)0.2、0.3、0.4 μL 上、下游引物BmF 和BmR（10 μmol/L）進(jìn)行考查。當(dāng)加入0.2 μL 引物時(shí)，藏柴胡可以擴(kuò)增出條帶，但條帶亮度較弱；隨著引物量增大，藏柴胡擴(kuò)增條帶亮度隨之變亮?？紤]擴(kuò)增的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)采用0.4 μL 的引物量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同引物量PCR 電泳圖Fig. 3 PCR electrophoresis of different primer quantities

2.4 不同酶的考查

除上述方法中使用的聚合酶2×Taq PCR MasteMix 外，本 實(shí) 驗(yàn) 對(duì)2×Taq Plus PCR Mix 酶 和2×Taq PCR StarMix 酶2 種聚合酶進(jìn)行考查。這兩種酶均能擴(kuò)增藏柴胡，而不能擴(kuò)增北柴胡，說(shuō)明特異性引物適用于多種酶，無(wú)單一局限性，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 兩種不同酶PCR 電泳圖Fig. 4 PCR electrophoresis of two different enzymes

2.5 重現(xiàn)性考查

用樣品信息表中的所有樣品對(duì)PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行重現(xiàn)性考查。反應(yīng)體系為20 μL，其中包括2×Taq PCR MasterMix 10 μL，正反向引物0.4 μL，DNA 模 板1 μL，無(wú) 菌 水 補(bǔ) 足 至20 μL；反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min，30 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s），72 ℃ 3 min。藏柴胡均能擴(kuò)增出425 bp 特異性條帶，而北柴胡均無(wú)條帶，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 擴(kuò)增條件及體系重現(xiàn)性PCR 電泳圖Fig. 5 PCR electrophoresis of amplification conditions and system reproducibility

2.6 摻偽檢出限考查

為考查該特異性PCR 擴(kuò)增對(duì)北柴胡中摻偽藏柴胡的鑒別能力。按不同的比例將藏柴胡摻于北柴胡中，充分混勻，即可得到摻有0%（北柴胡）、1%、3%、5%、10%、25%、50%、75%、100%（藏柴胡）的混合樣品，使用上述方法提取DNA 并進(jìn)行該特異性PCR 擴(kuò)增。北柴胡樣品中摻有1%以上藏柴胡時(shí)均可檢出，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 北柴胡中摻加不同比例藏柴胡的位點(diǎn)特異性PCR 電泳圖Fig. 6 PCR electrophoresis of Bupleurum chinense mixed with different proportions of Bupleurum marginatum var. stenophyllum

3 討論

DNA 條形碼技術(shù)在生物學(xué)分類(lèi)和鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。目前在藥用植物中可作為DNA 條形碼的序列包括ITS （internal transcribed spacer）、ITS2（intemal transcribed spacer 2）、rbcL （ribulose bisophosphate carboxylase）、matK （megakaryocyteassociated tyrosine kinase）等[5]。ITS 序列是位于核糖體DNA（rDNA）上具有高度重復(fù)，各位點(diǎn)間協(xié)同進(jìn)化，區(qū)分物種能力強(qiáng)的一段序列。在被子植物中，ITS 序列長(zhǎng)度600 ～ 700 bp，適用于屬、種的鑒定[6]。隨著PCR 技術(shù)成為國(guó)內(nèi)外分析DNA 的主要手段，分子鑒定中藥材有了更廣闊的前景。劉力等[7]利用DNA 芯片技術(shù)對(duì)6 種柴胡屬植物來(lái)源的生藥進(jìn)行鑒別。DNA 測(cè)序聚類(lèi)分析也是作為柴胡鑒別的方法之一。郝媛媛等[8]利用AFLP 揭示了柴胡種質(zhì)資源的遺傳差異。XIE H 等[9]對(duì)中國(guó)市場(chǎng)的36 種柴胡屬藥材應(yīng)用ITS 進(jìn)行同源性分析鑒別。

位點(diǎn)特異性PCR 已成為用于鑒別方法之一，具有穩(wěn)定、易操作且滿(mǎn)足實(shí)際需求的優(yōu)點(diǎn)。如李桂林等[10]通過(guò)位點(diǎn)特異性性PCR 實(shí)現(xiàn)了酸棗仁擴(kuò)增出66 bp的條帶，而混偽品未擴(kuò)增出條帶。高琳惠等[11]通過(guò)位點(diǎn)特異性PCR 證明了桃仁能擴(kuò)增出333 bp 的條帶，苦杏仁沒(méi)有該條帶。趙丹等[12]在特異性PCR 方法的基礎(chǔ)上通過(guò)熒光顯色鑒別太子參及其混偽品。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集北柴胡和藏柴胡樣品，基于ITS 序列設(shè)計(jì)藏柴胡鑒別引物，結(jié)果表明其引物特異性較好，鑒別能力高，可作為北柴胡與藏柴胡的鑒別引物。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)特異性鑒別引物并對(duì)PCR 擴(kuò)增條件進(jìn)行了一系列考查，最終得到穩(wěn)定、可重復(fù)的鑒別藏柴胡特異性PCR 方法和體系。此外本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)北柴胡摻偽藏柴胡的檢出限為1%，考慮到實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取樣的實(shí)際情況和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，該方法只能定性檢測(cè)北柴胡中是否摻有藏柴胡，不能作為摻偽藏柴胡DNA 的定量分析。