孫 妍，王 靜，侯 喆，綦 菲，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院，哈爾濱 150036）

麥冬為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物，麥冬味甘、微苦，性微寒，歸胃、肺、心經，有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩的功效，用于肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥,是中藥滋陰潤肺常用藥。《神農本草經》將麥冬列為養(yǎng)陰潤肺的上品，言其“久服輕身，不老不饑”?，F代研究表明，麥冬塊根中富含有多糖、皂苷、黃酮等有效成分，具有抗心肌缺血、抗心律失常、保護心肌、抗血栓形成、抗炎、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫、改善肝肺損傷及鎮(zhèn)咳等藥理作用[1-2]。

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）引起的呼吸道感染性肺炎[3]。兒童肺炎支原體肺炎的主要臨床特征為反復高熱、頑固性干咳、少痰或痰黏難咯等，從病機角度為外感風熱燥毒所致“肺燥咳嗽”，屬于燥邪犯肺的范疇[4]。臨床上提出了從燥論治小兒支原體肺炎，以“養(yǎng)陰清肺，潤肺止咳”為其主要治則，取得了較好療效[5-7]。

1 實驗材料

98-1-B 型電子調溫電熱套購于天津市泰斯特儀器有限公司；RE52-3 旋轉蒸發(fā)儀購于上海滬西分析儀器廠有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵購于鄭州長城科工貿有限公司；DZF-6210 型真空干燥箱購于上海雷韻儀器制造有限公司；UⅤ-160A 紫外可見分光光度計購于日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋購于上海精宏實驗設備有限公司；BSA22AS-CW 電子天平購于Sartorim 公司；LGJ-10F 冷凍干燥機購于北京松源華興科技發(fā)展有限公司。95%乙醇（批號：20130109）、無水乙醇（批號：20130422）、乙醚（批號：20130715）、氯化鈉（批號：20130319）、正丁醇（批號：20130522）購于天津市科密歐化學試劑有限公司；氯仿（批號：20121013）購于天津市博迪化工有限公司；丙酮（批號：20130325）購于天津市化學試劑六廠分廠；硫酸（批號：20110107）購于西隴化工股份有限公司；葡萄糖（批號：F20120815）購于國藥集團化學試劑有限公司；蒽酮（批號：20120313）購于北京化工廠；麥冬藥材（批號：130109）購于河北安國振宇藥業(yè)有限公司；魯斯可皂苷元（批號：L-009-130730）購于成都瑞芬思生物科技有限公司；牛血清白蛋白（批號：F20100405）購于中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司；氫氧化鈉（批號：20090613）購于天津市大陸化學試劑廠；考馬斯亮藍（進口分裝）購于美國sigma 公司；D101 大孔樹脂（批號：20130421）購于天津市匯達化工有限公司；磷酸（批號：20120207）購于西隴化工股份有限公司。

2 實驗方法

2.1 麥冬總皂苷的提取工藝麥冬飲片加10 倍量75%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，提取液回收乙醇得到浸膏后，經過D101 大孔樹脂柱，收集70%乙醇洗脫液，洗脫液回收乙醇后冷凍干燥，得麥冬總皂苷。

2.1.1 標準曲線制定精密稱取魯斯可皂苷元對照品，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液。精密吸取0.5、1、2、3、4、5、6 mL 標準液置于具塞試管中，于水浴中揮干溶劑。精密加入10 mL 高氯酸，搖勻，置熱水中保溫15 min，取出，冰水冷卻，高氯酸為空白，用紫外-可見分光光度法，在397 nm 波長處測定吸光度。以濃度為橫坐標（X），吸光值為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

2.1.2 正交試驗根據前期單因素試驗結果，以皂苷提取率為考察指標，選取乙醇濃度、提取次數、提取時間作為考察因素，各取3 個水平，進行L9（34）正交試驗設計，以確定麥冬皂苷提取的最佳工藝。因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.1.3 麥冬皂苷純化動態(tài)吸附試驗的單因素考察取預處理的3 根D101 大孔吸附樹脂柱，每根柱裝30 g樹脂，通過吸附時間、上柱體積、洗脫劑濃度及洗脫劑用量考察各因素對樹脂吸附效果及麥冬總皂苷含量的影響。單因素試驗設計見表2。

表2 單因素試驗設計

2.2 麥冬多糖提取分離麥冬飲片加10 倍量75%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，提取后揮干乙醇得干燥的麥冬藥渣，經水提醇沉、依次用無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌，洗滌后減壓得到粗多糖粉末，用sevage 法脫蛋白，得麥冬多糖。

2.2.1 對照品溶液的配制將干燥至恒重的葡萄糖對照品配成0.2 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。分別精密吸取標準液1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶中，以蒸餾水定容搖勻，得系列對照品溶液。

2.2.2 標準曲線的制備精密吸取上述系列對照品溶液1.0 mL，分別置于10 mL 具塞試管中，將試管置于冰水中，在冰水中分別向試管中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4 mL，待各管加完后同時搖勻，置于沸水浴中加熱10 min，取出，迅速冷卻至室溫，放置10 min，于627 nm 處測定吸光度。另精密吸取蒸餾水1.0 mL，同法操作，作為空白對照。以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，計算回歸方程。

2.2.3 樣品溶液多糖含量的測定分別精密吸取3 份濃度為0.1 mg/mL 麥冬粗多糖樣品溶液1.0 mL，于10 mL具塞試管中，按2.2.2 項下操作，測定吸光度，計算樣品多糖的百分含量。

2.2.4 Sevag 法脫除麥冬多糖中蛋白質[8]Bradford 法測定蛋白質含量。

2.3 麥冬有效部位對支原體感染小鼠臟器指數及肺組織炎癥的影響

2.3.1 實驗材料100 只BALB/c 小鼠，體質量18～22 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，SPF 級，許可證號SCXK（京）2012-0001。阿奇霉素分散片（批號：20130502）購于哈藥集團制藥六廠；養(yǎng)陰清肺糖漿（批號：3150021）購于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠；麥冬飲片（批號：130109）購于河北安國振宇藥業(yè)有限公司，經鑒定麥冬為四川麥冬Radix Ophiopogonis（Thunb.）Ker-Gawl.的干燥塊根；PPLO 培養(yǎng)基購于Becton，Dickinson and Company，USA；蘇木伊紅染液購于南京建成公司；防脫片購于哈爾濱博潤生物公司；甲醛、甲醇、乙醇、鹽酸、二甲苯等均為分析純。肺炎支原體國際標準菌株（ATCCFH15531）購于美國菌種保藏中心。DL-CJ-1W 生物凈化工作臺購于北京東連哈爾儀器制造有限公司；Milli-Q Reference system 自動雙重純水蒸餾器購于MILLI-Q公司；BP211D分析天平購于Sartorius公司；2、20、200 μL 微量加樣器購于Eppendoff 公司；MDF-382E -80 ℃低溫冰箱購于日本三洋公司；KD-TS3A 自動組織脫水機購于浙江金華科迪儀器設備有限公司；KD-BM 生物組織包埋機購于浙江金華科迪儀器設備有限公司；RM2235 組織切片機購于德國萊卡公司；BX4-1 生物顯微鏡購于OLYMPUS 公司；DP-72 組織生物信號采集分析系統(tǒng)購于OLYMPUS 公司。

2.3.2 動物分組100 只BALB/c 小鼠，體質量18～22 g，雌雄各半，隨機分為10 組，每組10 只。分別為空白對照組、模型對照組、阿奇霉素組、養(yǎng)陰清肺組、麥冬多糖高劑量組、麥冬多糖中劑量組、麥冬多糖低劑量組、麥冬皂苷高劑量組、麥冬皂苷中劑量組、麥冬皂苷低劑量組。

2.3.3 造模、給藥及標本采集先用乙醚麻醉，然后用微量加樣器吸取106 CCU/mL 肺炎支原體培養(yǎng)液緩緩滴入小鼠鼻孔內利用其自然吸氣式動作，將菌液吸入氣道至肺部。20 μL 感染3 d，3 d 后給藥，采取灌胃的方法給藥，空白組和模型組給等容積的生理鹽水，阿奇霉素組給藥5 d（第1 天給65 mg/kg，第2～5 天給32.5 mg/kg）、養(yǎng)陰清肺組（5 mL/kg）、麥冬多糖高劑量組（81.2 mg/kg）、麥冬多糖中劑量組（40.6 mg/kg）、麥冬多糖低劑量組（20.3 mg/kg）、麥冬皂苷高劑量組（66.8 mg/kg）、麥冬皂苷中劑量組（33.4 mg/kg）、麥冬皂苷低劑量組（16.7 mg/kg），連續(xù)給藥6 d，剝離胸腺和脾臟后立即電子天平稱重；剪取左肺組織，放入4%甲醛中固定。

2.3.4 臟器指數影響胸腺指數及脾臟指數計算依據以下公式：胸腺（脾臟）指數（g/100 g）=100×胸腺（脾臟）質量/體質量。

2.3.5 對肺組織病理變化的影響取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯中透明2 次，放入石蠟內進行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機上切片，將完全展開的蠟片貼附于清潔載玻片上，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.3.6 統(tǒng)計學方法采用 SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數據用均數±標準差（）表示，2 組間均數比較采用獨立樣本t檢驗。

3 實驗結果

3.1 麥冬皂苷含量測定結果

3.1.1 標準曲線在最大吸收波長397 nm 處檢測吸光度，得標準曲線回歸方程Y=7.001 4X＋0.033 7，相關系數R2=0.999 8。表明麥冬總皂苷在25～300 μg范圍內含量與吸光度呈良好線性關系。

3.1.2 正交試驗結果正交試驗結果及分析見表3，4。通過比較可以看出，各因素對麥冬皂苷提取率的影響為A ＞C ＞B，最佳的提取條件為A2B3C2。表4 可以看出A、B 和C 對麥冬皂苷的提取均有顯著性影響。由表3 可以看出提取次數的第2 水平和第3 水平的影響基本一樣，從節(jié)約成本的角度考慮，將提取次數確定為3 次。這樣提取的最佳工藝為用75%乙醇提取，提取時間2 h，提取3 次。

表3 提取工藝正交試驗結果

表4 提取工藝方差分析結果

3.1.3 動態(tài)吸附單因素試驗結果結果見圖1。單因素試驗結果表明，影響麥冬總皂苷含量的提取工藝條件范圍可以確定為：靜止時間50 min，吸附液量與樹脂的最佳比例為6:1，乙醇最佳洗脫濃度為70%，最佳的洗脫劑用量為6 倍樹脂體積的量。

3.1.4 麥冬皂苷含量測定分別稱取3 份麥冬藥材，每份10 g，以皂苷提取的最佳工藝條件進行提取，麥冬皂苷的得率為2.17%，皂苷的含量為59.21%。

3.2 麥冬多糖含量測定結果

3.2.1 葡萄糖標準曲線在最大吸收波長627 nm 處檢測吸光度，得回歸方程Y=9.905X＋0.007 1，相關系數R2=0.998。表明在0.020～0.10 mg/mL 范圍內葡萄糖的含量與吸光度呈良好線性關系。

圖1 動態(tài)吸附單因素試驗結果

3.2.2 麥冬多糖含量測定 見表5。多糖提取率（%）=粗多糖質量/藥材質量×100%=11.8%

表5 多糖含量測定結果

3.2.3 Sevage 法脫除麥冬多糖中蛋白質

3.2.4 牛血清蛋白溶液標準曲線 牛血清白蛋白溶液標準曲線回歸方程為Y=0.006 2X＋0.182 7，相關系數R2=0.998 5。表明在10～80 μg 范圍內，牛血清白蛋白的含量與吸光度呈良好線性關系。

3.2.5 Sevage 法脫除麥冬多糖中蛋白質試驗結果 通過氯仿正丁醇體積比為5:1，樣品和Sevage 試劑體積比為1:1，脫蛋白2 次后，經蒽酮硫酸法測定除蛋白后的多糖百分含量由62.16%提高到64.38%，證明多糖純化效果較好。

3.3 臟器指數及病理實驗結果

3.3.1 小鼠狀態(tài)觀察 空白組小鼠目光有神，反應靈敏，活潑好動，毛色有光澤，呼吸平穩(wěn)，進食正常，體質量逐漸增加；模型組小鼠毛色枯槁無光澤、易脫落，目光呆滯，精神萎靡，呼吸急促不暢，鼻周可見膿性分泌物，偶有血絲，舌質暗，肺部出現明顯的肺濕呼吸音，進食及活動減少；體質量雖有增加，但低于空白對照組；各給藥組癥狀有所減輕，毛色光澤尚可，有脫落，反應較迅速，精神及活動尚可，食量、飲水較正常，一般狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組。

3.3.2 肺組織形態(tài)觀察 空白組小鼠肺外觀無異常，呈粉紅色，表面光滑，彈性好。模型組小鼠肺部病變明顯，外觀充血、水腫，暗紅色，嚴重者肺葉分布散在大小不等的壞死灶。各給藥組與模型組相比較，雙肺色澤、硬度、彈性、體積、結節(jié)樣改變等情況有不同程度的好轉，肺臟輕度水腫，但個別鼠仍可見兩肺的顏色略暗紅，大部分動物肺臟彈性尚可，部分肺葉偶見散在的點狀灰白色斑塊。

3.3.3 藥物對臟器指數的影響 見表6。

表6 對小鼠脾和胸腺指數的影響（，n =10） g/100 g

表6 對小鼠脾和胸腺指數的影響（，n =10） g/100 g

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

與空白對照組比較，模型組的脾臟和胸腺指數明顯降低（P＜0.05）。脾臟指數顯示，與模型組相比麥冬皂苷中、低劑量組及麥冬多糖低劑量組具有極顯著差異（P＜0.01），阿奇霉素組、養(yǎng)陰清肺組及麥冬多糖中劑量組具有顯著差異（P＜0.05）；胸腺指數顯示，與模型組對比，養(yǎng)陰清肺組，麥冬皂苷中、低劑量組，麥冬多糖中、低劑量組具有極顯著差異（P＜0.01），阿奇霉素組及麥冬皂苷高劑量組具有顯著差異（P＜0.05）。

3.3.4 HE 染色觀察 由肺組織切片可見空白組小鼠肺組織結構清晰正常，無間質性肺炎改變，僅個別偶有淋巴樣細胞浸潤，模型組小鼠肺組織有明顯炎癥，炎癥反應包括氣管支氣管周圍的炎性細胞浸潤，氣管支氣管腔內的炎性細胞滲出，偶有充血，血管周圍的炎性細胞浸潤和間質性肺炎，以上均不同程度的存在，說明造模成功。各組病理結果圖片見圖2。

圖2 麥冬有效部位對支原體感染小鼠肺組織病變的影響（HE，×20）

4 討論

本試驗通過對麥冬皂苷提取工藝研究，提取皂苷后的殘渣收集，再進行多糖提取工藝的研究，達到對麥冬飲片的綜合利用。結果顯示，麥冬皂苷的得率為2.17%，皂苷含量為59.21%；麥冬粗多糖百分含量為62.16%，脫蛋白后含量可以達到64.38%，多糖提取率為11.8%。

脾臟和胸腺是人體非常重要的免疫器官，脾指數和胸腺指數的變化直接反映了機體的免疫功能狀態(tài)。實驗結果顯示，模型組小鼠的脾臟指數、胸腺指數顯著低于空白組（P＜0.05），說明在小鼠感染肺炎支原體肺炎之后免疫指數低下，麥冬多糖及麥冬皂苷可明顯增加脾臟、胸腺質量，提升臟器指數，說明麥冬有效部位可提高肺炎支原體肺炎免疫功能。

肺炎支原體肺炎感染小鼠肺組織的主要病理表現為間質性肺炎和細支氣管肺炎，通過實驗結果可以看出，麥冬多糖及麥冬皂苷能明顯減輕肺炎支原體肺炎感染引起的小鼠肺部炎癥，可調節(jié)肺組織形態(tài)結構趨向正常。