牛志紅，任建樂，王喜珍，張衛(wèi)兵，張 鼎，趙宇軍，寧官保，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜及野生動(dòng)物共患的以奇癢、化膿性腦炎等神經(jīng)癥狀為主的急性接觸性傳染病[1]。PRV 為皰疹病毒科、α- 皰疹病毒亞科、水痘病毒屬的病毒成員[2-3]。該病毒可引起母豬流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、仔豬死亡等臨床癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

自20 世紀(jì)70 年代末，我國引進(jìn)匈牙利Bartha-K61 疫苗，并開始在豬場進(jìn)行免疫，利用通過使用標(biāo)記疫苗和各自的配套診斷性檢測區(qū)分感染與疫苗接種動(dòng)物DIVA 策略，使我國的豬偽狂犬病疫情逐步得到控制[5-6]，但從2011 年開始多個(gè)免疫Bartha-K61 疫苗的豬群相繼暴發(fā)由PRV 變異株引起的PR，隨后從河南、河北、山東等地蔓延至全國[3]，并且PRV 變異株可引起人的呼吸功能障礙和腦炎等癥狀，成為潛在的人畜共患病原[7]。有研究表明，PRV 變異株基因組呈現(xiàn)較大的變異，對(duì)不同日齡的豬均有較強(qiáng)的致病性，其中，gE的變異在一定程度上可導(dǎo)致PRV 變異株致病力增強(qiáng)[8]；變異株gC的變異是引起B(yǎng)artha-K61 血清中和能力降低的關(guān)鍵因子，并且gB、gC和gD變異均可導(dǎo)致Bartha-K61為宿主提供免疫保護(hù)能力下降[9-10]。另外，自2019 年以來多份最新研究發(fā)現(xiàn)，PRV 發(fā)生了新的重組變異，PRV 變異株可與Bartha-K61 的gB和gC基因產(chǎn)生重組，形成新的重組變異株，可致病毒的致病性發(fā)生相應(yīng)的改變，并且新的重組變異將可能加速PRV 在不同物種間的傳播[11-13]。

為調(diào)查山西省豬偽狂犬病病毒流行及其變異情況，本研究對(duì)2019 年采集的山西省部分規(guī)模豬場的4 346 份豬血清及964 份豬疑似病料進(jìn)行血清學(xué)gB及gE抗體及病原學(xué)檢測分析，并對(duì)PRV分離株的gC和gE基因進(jìn)行遺傳變異分析，以期為山西省PRV 的防控和凈化提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero-E6）由中國科學(xué)院微生物研究所饋贈(zèng)；SX1801 和SX802 毒株均為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

gB-ELISA 檢測試劑盒、gE-ELISA 檢測試劑盒，均購自美國愛德士（IDEXX）公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化有限科技公司；豬偽狂犬病病毒實(shí)時(shí)熒光PCR 試劑盒，購自湖南國測生物科技有限公司；DMEM、FBS，購自賽默飛世爾科技有限公司；FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素- 鏈霉素- 兩性霉素混合液、去離子水，均購自索萊寶科技有限公司；PreMix Taq 酶，購自大連寶日生物技術(shù)有限公司。

QuantStudio6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，購自美國ABI 公司；徠卡倒置顯微鏡，購自德國徠卡公司；PCR 擴(kuò)增儀，購自德國Eppendorf 公司；DYY-8C 型電泳儀，購自北京市六一儀器廠；SYNGENE 全自動(dòng)凝膠成像分析儀，購自美國SYNGENE 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的采集與處理 2019 年1—12 月在山西省6 個(gè)gE基因缺失苗免疫豬場，采集不同生長階段的健康豬新鮮血清，共4 346 份，置于-20 ℃?zhèn)溆?。采集豬場疑似病豬的全血、臍帶、淋巴結(jié)、腦及胎兒胎衣等組織，共964 份，一部分加入液氮碾磨成組織粉末用于qPCR 檢測，剩余部分置于－80 ℃保存。

1.3.2 血清及病原檢測 利用PRVgE-ELISA、PRVgB-ELISA 抗體試劑盒對(duì)采集的血清樣本進(jìn)行g(shù)E、gB抗體檢測，具體操作和判定根據(jù)說明書進(jìn)行。采用病毒DNA/RNA 提取試劑盒對(duì)組織樣品進(jìn)行PRV 基因組提取，然后使用豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光PCR 試劑盒進(jìn)行qPCR，具體操作及結(jié)果判定根據(jù)說明書進(jìn)行。

1.3.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考Ea 株（GenBank登錄號(hào)KU315430.1）基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性并合成針對(duì)gC和gE的特異性引物（表1）。引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

表1 PRV 引物序列

1.3.4 病毒基因組的提取及PCR 鑒定 取50 mg陽性病料反復(fù)凍融3 次，置于組織碾磨器中碾成勻漿液，取200 μL 勻漿液按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取DNA。利用gE檢測引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，陽性PCR 產(chǎn)物送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.3.5 病毒分離培養(yǎng) 將PCR 鑒定為陽性的組織勻漿液離心取上清，0.22 μL 濾器過濾除菌后，取500 μL 接種于單層Vero 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱吸附1 h 后，棄上清加入含2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，每日觀察細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），且細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，收取病液，若無病變則繼續(xù)盲傳，持續(xù)盲傳3 代無病變則視為陰性。

1.3.6 病毒IFA 鑒定 將病毒分離株接種單層Vero 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照（SX1801 與SX1802）及正常細(xì)胞對(duì)照，感染36 h 出現(xiàn)明顯的CPE 時(shí)，棄上清，PBS 洗滌3 次，以預(yù)冷的無水乙醇4 ℃固定30 min，棄上清，PBS 洗滌3 次，以抗PRV 的gB鼠源單克隆抗體（1∶2 000）為一抗，37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌3 次；以FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶200）為二抗，37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌3 次，于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.7 PRV 分離株gC、gE基因遺傳變異分析 提取病毒DNA，利用表1 中的gC、gE基因克隆引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序，利用生物學(xué)分析軟件DNAStar 7.1、MEGA 5.0 將分離株與近年來山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院生物制品實(shí)驗(yàn)室分離鑒定（SX1801 與SX1802） 的及GenBank 中已登錄的PRV 參考毒株gC和gE核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析分離株的序列特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)及病原學(xué)檢測

表2 血清學(xué)檢測結(jié)果

將2019 年收集的山西省6 個(gè)不同豬場免疫豬群的血清，進(jìn)行偽狂犬gE、gB抗體檢測。檢測結(jié)果表明（表2），臨汾市A 豬場、朔州市A 豬場、朔州市B豬場、汾陽市A 豬場、呂梁市A 豬場、呂梁市B 豬場gE陽性率分別為0、0、18.2%、6.3%、3.5%、39.5%；gB陽性率分別為100%、95.6%、98.5%、95.5%、98.5%、97.6%。此次調(diào)查共檢測血清樣品4 346 份，其中，PRVgE抗體陽性率為11.3%，gB陽性率平均為97.6%，有4 個(gè)豬場為PRVgE抗體陽性豬場。

2019 年隨機(jī)收集山西省4 個(gè)不同豬場的部分免疫豬群的全血、胎兒胎衣、臍帶、淋巴結(jié)、腦等器官組織，共964 份樣本，經(jīng)qPCR 擴(kuò)增檢測顯示（表3），僅朔州市B 豬場發(fā)現(xiàn)2 例PRV 感染病例，豬場病原檢出率為1.79%。其中，汾陽市A 豬場、呂梁市A 豬場、呂梁市B 豬場陽性病例個(gè)數(shù)均為0。綜合血清學(xué)和病原學(xué)結(jié)果顯示，盡管個(gè)別豬場中的gE抗體陽性率較高，但豬場的病原檢出率較低，總體病原檢出率僅為0.21%。

表3 qPCR 檢測結(jié)果

2.2 組織病料PCR 擴(kuò)增

將qPCR 檢測為PRV 陽性的2 份組織病料研磨后，提取病毒基因組，利用gE檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖1 可知，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后條帶單一，大小為635 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 PRV 的分離及IFA 鑒定

將2 份PRV 陽性組織的勻漿液過濾除菌后，分別接種于單層Vero 細(xì)胞，48 h 后，其中1 份陽性樣品可致Vero 細(xì)胞產(chǎn)生固縮、變圓和脫落等疑似PRV的CPE 現(xiàn)象，并將該分離毒株命名為SX1911。以PRVgB單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 為二抗，對(duì)分離病毒株進(jìn)行IFA 鑒定，結(jié)果顯示（圖2），分離株SX1911 與陽性對(duì)照組（2018 年分離株SX1801與SX1802）IFA 檢測均出現(xiàn)特異性綠色熒光。

2.4 PRV 分離株gC 基因遺傳變異分析

PCR 擴(kuò)增分離株SX1911gE、gC全基因測序和拼接后分別得到1 740、1 464 bp 的完整的開放閱讀框。通過3 株山西PRV 分離株（SX1911、SX1801 和SX1802）的gC全長基因核苷酸及氨基酸序列與GenBank 登錄的17 株P(guān)RV 參考株同源性分析顯示（表4），3 株P(guān)RV 分離株與國外毒株（Kaplan、Becker 等毒株） 核苷酸和氨基酸相似性分別為94.9%～96.3%和90.4%～93.9%；與國內(nèi)經(jīng)典株（SC、Ea 等）核苷酸與氨基酸相似性分別為96.8%～99.7%和94.3%～99.2%；與國內(nèi)2011 年以后分離的毒株核苷酸與氨基酸相似性均為99.8%～100%；分離株間的核苷酸與氨基酸相似性分別為99.9%～100%和99.8%～100%。

表4 核苷酸和氨基酸的相似性分析 %

針對(duì)3 株P(guān)RV 變異株gC氨基酸序列進(jìn)行分析表明，相較于國外流行株（Kaplan、Bartha 等），絕大部分PRV 變異株存在多個(gè)變異位點(diǎn)：在63—69 位氨基酸連續(xù)插入AASTPA7 個(gè)氨基酸，在43位點(diǎn)E→A（除Bartha 株外），在431 位點(diǎn)L→M，在130437 位點(diǎn)F→V，在449 位點(diǎn)V→A，在457 位點(diǎn)S→T，在461 位點(diǎn)V→T，在467 位點(diǎn)G→A，在142 位點(diǎn)Y→C，在190、191 位點(diǎn)均發(fā)生2 個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異ED→VV（除Becker 和ADV32711Italy 株外），在243 位點(diǎn)S→H，在485—487 位點(diǎn)AGP→SAL。3 株山西PRV 分離株除SX1801 在3 位點(diǎn)發(fā)生一個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變S→W 外，其他氨基酸變異位點(diǎn)均與國內(nèi)早期分離的變異株相同（圖3）。

基于gC基因進(jìn)行遺傳演化分析結(jié)果表明（圖4），國外毒株Becker、NAI3 等毒株屬于基因Ⅰ型，國內(nèi)PRV 毒株為基因Ⅱ型。基因Ⅱ型病毒形成2 個(gè)獨(dú)立的亞分支，其中，國內(nèi)變異株為一個(gè)單獨(dú)的亞分支，而國內(nèi)經(jīng)典毒株分別形成不同獨(dú)立的亞分支。經(jīng)典毒株Fa、Ea 等毒株與變異株親緣關(guān)系近，而SC 株與變異株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本試驗(yàn)研究的3 株P(guān)RV分離株與2011 年以后分離的PRV 國內(nèi)變異株位于基因Ⅱ型的同一亞分支，且高度同源。

2.5 PRV 分離株gE 基因遺傳變異分析

針對(duì)SX1911、SX1801 和SX1802 株的gE全長基因核苷酸及氨基酸序列與GenBank 登錄的16 株P(guān)RV 參考株進(jìn)行了同源性分析。結(jié)果顯示（表4），3 株山西PRV 分離株與國外毒株（Becker、Kaplan等毒株）核苷酸和氨基酸同源性分別為97.9%～98.2%和94.5%～95.0%；與國內(nèi)經(jīng)典株（SC、Ea 等）核苷酸同源性均為99.7%，氨基酸同源性為98.4%～98.6%；與國內(nèi)2011 年以后分離的毒株核苷酸與氨基酸同源性分別為99.8%～100%和98.4%～99.8%；分離株之間的核苷酸與氨基酸同源性分別為99.9%～100%和99.7%～99.8%。

基于gE蛋白氨基酸序列比對(duì)顯示，與國外毒株相比，國內(nèi)PRV 分離株gE基因均存在17 個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)。除此之外，與經(jīng)典株相比，國內(nèi)PRV 變異株在55 氨基酸位點(diǎn)均存在突變位點(diǎn)D→G，在497 氨基酸位點(diǎn)插入一個(gè)天冬氨酸。與國內(nèi)外經(jīng)典株相比，變異株（除TJ 外）均在449 氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變：V→I，與此同時(shí)，大多數(shù)變異株（除HLJB、TJ、SX1911 外）在511 氨基酸位點(diǎn)也發(fā)生突變：G→S（圖5）。

gE基因遺傳演化與gC相一致，如圖6所示，國內(nèi)PRV 毒株與國外毒株處于2 個(gè)不同的分支，國外PRV 毒株屬于基因Ⅰ型，國內(nèi)PRV 毒株屬于基因Ⅱ型。國內(nèi)分離株具有共同的起源，但Ea、Fa、SC 等經(jīng)典株毒株處于基因Ⅱ型的一個(gè)亞分支，2011 年以后的PRV 分離株位于基因Ⅱ型的另一個(gè)亞分支，說明國內(nèi)流行的變異株親緣性較近。本試驗(yàn)研究的3 株P(guān)RV 分離株與國內(nèi)流行株HB1201等分離株處于同一亞分支，同源性較高。

3 結(jié)論與討論

自2011 年以來，PRV 變異株給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，由于PRV 變異株的致病機(jī)制尚未完全明確，并且疫苗Bartha-K61 不能提供完全的免疫保護(hù)，但目前通過DIVA 策略仍是防控和凈化PRV 感染的重要措施。因此，本研究通過對(duì)山西省部分地區(qū)PRV 流行及變異情況分析發(fā)現(xiàn)，山西部分規(guī)模豬場仍存在PRV 野毒感染，并且呈現(xiàn)不同程度的gE抗體陽性；成功分離到1 株P(guān)RV 變異株，命名為SX1911；遺傳變異分析表明，分離株SX1911 與實(shí)驗(yàn)室已保存毒株均屬于變異毒株。該研究可為山西省的PRV 流行情況及疫病防控提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。

豬偽狂犬病在山西省部分地區(qū)仍廣泛流行。2019 年對(duì)山西省部分地區(qū)的免疫豬場所采血清樣品進(jìn)行了血清學(xué)檢測。結(jié)果表明，PRV 感染豬場的陽性率高達(dá)66.67%，大部分豬場血清樣品gE抗體陽性率在3.5%～39.5%，但仍有部分gE抗體陰性豬場存在，推測規(guī)模化豬場之間的防控措施以及生產(chǎn)管理水平的不同可能是影響PRV 感染率差異的原因之一。寧慧波等[14]通過對(duì)2019 年山西地區(qū)豬偽狂犬病的gE抗體調(diào)查結(jié)果顯示，感染豬場陽性率達(dá)71.43%，血清樣品gE陽性率達(dá)到52.16%，略高于河北和內(nèi)蒙古，但低于北京。與此同時(shí)，陳馳等[15]研究發(fā)現(xiàn)，2018—2019 年江蘇、河南和江西3 個(gè)省豬場gE陽性率達(dá)到71.7%～88.24%，且樣品gE抗體陽性率分別為38.44%、63.28%和30.48%。由此表明，目前山西省部分地區(qū)豬場PRV 感染情況與全國水平大致相同，仍然廣泛流行。本研究在所采樣豬場中的血清學(xué)結(jié)果顯示，PRVgE抗體陽性率較高，但qPCR 僅檢出2 例陽性病例，其原因可能與組織樣本容量和種類較少，或病毒轉(zhuǎn)為潛伏感染有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，部分豬場雖然受到PRV 變異毒株的感染，但無明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)為種豬群gE抗體轉(zhuǎn)陽或陽性率升高[16]；同時(shí)PRV 野毒的檢出率跟采樣季節(jié)有關(guān)系，殷鑫歡等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PRV的檢出率在夏季（1.5%）和秋季（1.6%）明顯比春季（9.1%）和秋季（33.0%）低。這些數(shù)據(jù)表明，目前山西及國內(nèi)其他省份仍然面臨著嚴(yán)峻的豬偽狂犬病防控壓力，因此，豬場應(yīng)適度優(yōu)化免疫程序，降低豬偽狂犬病的臨床發(fā)病率，加強(qiáng)生物安全措施，防止病毒的傳入和傳播，逐步凈化豬偽狂犬病[18]。

山西PRV 流行毒株仍為變異株。本研究針對(duì)新分離毒株SX1911 與山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實(shí)驗(yàn)室已保存的SX1801 和SX1802 的gC和gE基因遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)毒株均與目前國內(nèi)流行的毒株一致，位于基因Ⅱ型的同一個(gè)亞分支，屬于變異株。進(jìn)一步序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，相比于歐美毒株，3 個(gè)毒株的gC在第63 位點(diǎn)存在1 個(gè)AAASTPA 連續(xù)7 個(gè)氨基酸插入，這個(gè)位點(diǎn)的插入均與目前國內(nèi)流行的毒株相一致。PRV 糖蛋白gC是能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的重要免疫原，并且已有研究證明，gC變異是引起抗Bartha-K61 血清中和變異株的關(guān)鍵因素[10]；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，gC的變異主要存在于N 端的13-243 aa，其N 端存在介導(dǎo)PRV 與靶細(xì)胞的吸附的肝素結(jié)合域（heparin-bindingdomains，HBDs）[19]，因此，gC的變異可能影響PRV 與靶細(xì)胞的吸附能力。最新研究表明，目前多株已分離的PRV 毒株基因發(fā)現(xiàn)重組變異，其中，變異株可與疫苗株Bartha-K61 的gC基因發(fā)生重組[11]，但是在本研究中并未發(fā)現(xiàn)重組，SX1911、SX1801 和SX1802 這3 株病毒的其他基因是否能夠產(chǎn)生重組變異，需要全基因測序進(jìn)一步分析。gE是決定PRV 的毒力的因子之一，且gE變異可部分增強(qiáng)變異株的致病性。本研究發(fā)現(xiàn)，與國外株相比，所有國內(nèi)分離株均具有17 個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，與孫穎等[20]的研究結(jié)果一致；所有變異株gE在48 和497 氨基酸位點(diǎn)均插入一個(gè)天冬氨酸；趙鴻遠(yuǎn)等[21]研究認(rèn)為，該突變可作為PRV 變異株診斷的分子特征。除此之外，大部分變異株還有個(gè)別氨基酸位點(diǎn)突變，這些變異可能是PRV 逐步進(jìn)化形成獨(dú)立亞分支的原因。

本次流行病學(xué)調(diào)查反映了山西省部分地區(qū)PRV 流行情況，結(jié)果表明，PRV 仍然在山西省廣泛流行，流行毒株為變異株；血清學(xué)結(jié)果顯示，疫苗免疫后可產(chǎn)生高水平抗體，但仍可被PRV 野毒感染，提示應(yīng)從當(dāng)前PRV 流行變異株中選取合適的毒株研發(fā)疫苗，同時(shí)優(yōu)化管理程序?yàn)閮艋疨RV 提供高效防控措施。