任建功，王青林，孫朝徽，于姍姍，王桂興，于清海，劉 霞，宋立民，司 飛

( 1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 北戴河中心實驗站,河北 秦皇島 066100; 2.河北科技師范學(xué)院 動物科技學(xué)院, 河北 秦皇島 066600; 3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院,河北 秦皇島 066003; 4.天津市水產(chǎn)研究所,天津 300221 )

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)，屬鲉形目、鲉科、平鲉屬，別名黑鲪、黑頭等，是廣泛分布在我國渤海、黃海和東海近海海域的一種底層巖礁性魚類[1-2]。許氏平鲉肉質(zhì)新鮮細(xì)嫩、脂肪含量較少，具有生長速度快、抗逆性強、無遠(yuǎn)距離洄游優(yōu)點，是北方海洋牧場和人工魚礁區(qū)的主要經(jīng)濟物種，也是我國北方沿海、日本以及韓國重要的增養(yǎng)殖品種[3-7]。近十幾年來，由于過度捕撈和環(huán)境破壞，許氏平鲉資源出現(xiàn)明顯衰退[8]。為了恢復(fù)許氏平鲉漁業(yè)資源，我國早在20世紀(jì)90年代中期就在山東半島沿海陸續(xù)開展小規(guī)模增殖放流工作，截至2009年累計放流許氏平鲉苗種452.4萬尾。2010年以后，放流數(shù)量逐年增加，放流范圍也擴大到河北、天津和江蘇[9]。截至2017年，山東省累計放流許氏平鲉等巖礁魚類2.58億尾[10]。雖然增殖放流活動在促

進(jìn)漁民增產(chǎn)增收和修復(fù)漁業(yè)種群資源方面起到了積極的作用[11]，但大規(guī)模放流人工培育苗種對許氏平鲉的遺傳多樣性影響不容忽視[12-13]，因此，亟需開展黃渤海許氏平鲉遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析工作。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，它是衡量一個種群種質(zhì)資源品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)[14]。深入研究遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性是科學(xué)制定資源保護(hù)與開發(fā)規(guī)劃的基礎(chǔ)[15]。微衛(wèi)星標(biāo)記，又稱簡單序列重復(fù)(SSR)，在基因組中數(shù)量眾多且分布均勻，具有多態(tài)性豐富、雜合度高和檢測方便等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于群體遺傳多樣性的研究[16-21]。目前利用微衛(wèi)星標(biāo)記對許氏平鲉遺傳多樣性比較的研究已有報道，王文琪等[17,22]分別利用18對和8對微衛(wèi)星標(biāo)記對4個山東許氏平鲉野生群體和9個中日

沿海的許氏平鲉野生群體進(jìn)行了遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究。但許氏平鲉放流群體對野生群體遺傳多樣性影響的相關(guān)報道較少，作為近年來增殖放流數(shù)量和范圍逐漸增大的經(jīng)濟魚種，其遺傳多樣性值得持續(xù)關(guān)注。鑒于此，筆者利用10對微衛(wèi)星標(biāo)記對來自遼寧丹東、營口，河北北戴河，山東長島、威海和日照6個許氏平鲉地理群體的180尾個體進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，從分子遺傳學(xué)角度對許氏平鲉增殖放流可能引起的遺傳多樣性影響進(jìn)行初步評估，以期為我國許氏平鲉種質(zhì)資源保護(hù)和增殖放流工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA提取

2017年9月，在遼寧、山東等沿海采集許氏平鲉各30尾，6個地理群體共計180尾(圖1)。剪取胸鰭平鋪于采樣紙上，37 ℃烘干后短期保存，待全部樣本采集完畢后，使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP324)提取基因組DNA。以質(zhì)量濃度大于20 μg/mL、260 nm吸光度/280 nm吸光度(D260/D280)1.6～1.8為標(biāo)準(zhǔn)，用紫外分光光度計分別檢測DNA的質(zhì)量和純度，未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的樣本重新提取。

圖1 許氏平鲉6個地理群體采樣點(▲)Fig.1 Sampling sites (▲) of 6 geographical populations of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

1.2 微衛(wèi)星分析

自文獻(xiàn)[17,22]中的26對許氏平鲉微衛(wèi)星標(biāo)記中選取10對多態(tài)性高的標(biāo)記用于本試驗。各標(biāo)記的名稱、引物序列、退火溫度等見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括模板DNA 1 μL，2×PCRmix 7.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，純水補至15 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃變性3 min；然后94 ℃ 20 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。PCR擴增在PE9700型PCR儀上進(jìn)行。

將HIDI與分子量內(nèi)標(biāo)ROX500按20∶1的體積比混勻后，取9 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物。95 ℃變性3 min，立即冰水浴。然后使用ABI3730XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，利用GeneMarker中的Fragment(Plant)片段分析軟件對測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置進(jìn)行比較分析，得到片段大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Genepop 4.0軟件分析分型結(jié)果，統(tǒng)計各位點等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量，并分析群體的哈迪—溫伯格平衡狀態(tài)，計算群體間各群體的基因分化系數(shù)、基因流、遺傳相似性系數(shù)和Nei氏遺傳距離。采用Arlequin 3.5軟件對許氏平鲉6個地理群體進(jìn)行分子方差分析。使用MEGA 5.0軟件，采用非加權(quán)組平均法根據(jù)6個地理群體的遺傳距離進(jìn)行聚類，采用Structure 2.3軟件進(jìn)行遺傳組分分析。

表1 10對微衛(wèi)星標(biāo)記的位點、引物序列、退火溫度及GenBank登錄號Tab.1 Locus, primer sequence, annealing temperature and GenBank accession No. of 10 microsatellitemarkers used in the experiment

2 結(jié) 果

2.1 遺傳多樣性參數(shù)

10對微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量見表2，6個地理群體的平均等位基因數(shù)為17.200～19.900個，平均觀測雜合度為0.769～0.923，平均期望雜合度為0.871～0.920，平均多態(tài)信息含量為0.845～0.897。其中，北戴河群體的平均等位基因數(shù)最多，為19.900，丹東群體的平均等位基因數(shù)最少，為17.200。平均觀測雜合度最大的是威海群體(0.923)，最小的是北戴河群體(0.769)。平均期望雜合度最大的是長島群體(0.920)，最小的是北戴河群體(0.871)。哈迪—溫伯格平衡檢驗結(jié)果顯示，在6個群體10個多態(tài)微衛(wèi)星位點中大部分未偏離平衡狀態(tài)(P>0.05)。丹東群體有1個位點偏離平衡；北戴河、長島、日照群體有3個位點偏離平衡；營口群體最多，有5個位點偏離平衡(P<0.05)，威海群體沒有偏離哈迪—溫伯格平衡(表2)。

表2 許氏平鲉6個地理群體的哈迪—溫伯格平衡檢驗及遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity and Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) test in 6 geographical populations of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.2 遺傳分化及聚類

6個群體各位點的基因分化系數(shù)為0.019～0.093(表3)，位點JQ246469的基因分化系數(shù)最大(0.093)，位點JQ246481的基因分化系數(shù)最小(0.019)。6個群體各位點的基因流為2.445～12.213(表3)。位點JQ246481的基因流最大，為12.213，位點JQ246469的基因流最小，為2.445。分子方差結(jié)果顯示，主要的變異來源為群體內(nèi)個體間(3.975%)和個體間(93.078%)；而群體間變異所占比例較低，為2.947%(表4)。

表3 許氏平鲉6個地理群體各位點的基因分化系數(shù)和基因流Tab.3 Coefficient of gene differentiation Gst and gene flow Nm among 6 geographical populations of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

表4 許氏平鲉6個地理群體分子方差分析結(jié)果Tab.4 AMOVA among 6 geographical populations of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

6個群體相互間的遺傳相似系數(shù)和Nei氏遺傳距離見表5，分別為0.434～0.888和0.119～0.835。丹東群體和威海群體的遺傳距離最近(0.119)，而北戴河群體和營口群體的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.835)。根據(jù)各群體之間的遺傳距離，對6個群體進(jìn)行聚類(圖2)。北戴河群體獨立為1支；丹東群體和威海群體先聚成1支，再與長島群體聚為1支；日照群體和營口群體聚為1支。

表5 許氏平鲉6個地理群體遺傳相似性系數(shù)(對角線上方)和Nei氏遺傳距離(對角線下方)Tab.5 Genetic identity (under diagonal) and Nei′s unbiased genetic distances (above diagonal) of 6 geographical populations of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

圖2 根據(jù)Nei氏遺傳距離用非加權(quán)組平均法構(gòu)建的許氏平鲉6個 地理群體的進(jìn)化樹Fig.2 UPGMA dendrogram of 6 geographical populations of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii based on Nei′s unbiased genetic distances

2.3 遺傳組分分析

采用Structure 2.3軟件進(jìn)行遺傳組分分析，6個許氏平鲉群體中共包含3種遺傳組分(圖3；紅色、藍(lán)色、綠色分別表示3種不同的遺傳組分)。丹東群體和威海群體的遺傳混雜最少，北戴河群體和長島群體次之，營口群體和日照群體的遺傳混雜較多。

圖3 6個許氏平鲉地理群體的遺傳組分分析Fig.3 Genetic component among 6 geographical populations of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

3 討 論

3.1 許氏平鲉不同地理群體的遺傳多樣性分析

多態(tài)信息含量是衡量標(biāo)記遺傳信息含量高低的主要參數(shù)，當(dāng)多態(tài)信息含量>0.5時，表明該遺傳標(biāo)記具有高度的可提供遺傳信息性，即高度多態(tài)[23]。本研究中，各標(biāo)記的多態(tài)信息含量為0.668～0.959，表明所選用的微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度多態(tài)性，可以用于許氏平鲉的遺傳多樣性分析。等位基因數(shù)和期望雜合度是分析群體遺傳多樣性的主要指標(biāo)[24]。本研究中，各標(biāo)記在6個群體中的平均等位基因數(shù)為17.200～19.900，各群體等位基因數(shù)排序為北戴河(19.900)>營口(19.700)>長島(19.400)=日照(19.400)>威海(18.600)>丹東(17.200)(表2)。王文琪等[17]對榮成1、榮成2、即墨、龍口4個群體進(jìn)行微衛(wèi)星分析，17個微衛(wèi)星位點中每個位點檢測到的等位基因數(shù)為2～10個，低于本研究結(jié)果，推測可能因為使用不同微衛(wèi)星標(biāo)記的原因。張輝[22]研究表明，從丹東、煙臺、威海和日照采集的許氏平鲉野生群體的等位基因數(shù)為11.800～13.500，結(jié)果與本研究基本相符。較高的等位基因數(shù)表明許氏平鲉各群體仍具有較高的遺傳多樣性豐富度。期望雜合度是反映微衛(wèi)星標(biāo)記在群體中遺傳變異程度的最優(yōu)參數(shù)，是描述遺傳多樣性的最適參數(shù)，雜合度越高，表明群體內(nèi)遺傳多樣性就越高，遺傳變異程度就越大，反之則群體內(nèi)遺傳變異程度就小[25]。本研究期望雜合度在6個群體中的變化為0.871～0.920 (表2)，各群體排序為長島(0.920)>丹東(0.905)>日照(0.904)>威海(0.903)>營口(0.882)>北戴河(0.871)；王文琪等[17]分析，榮成等4個野生許氏平鲉群體的期望雜合度為0.447～0.590，張輝[22]研究表明，丹東等4個野生許氏平鲉群體的期望雜合度為0.6848～0.8643；三者結(jié)果基本一致。王文琪等[17]研究樣本采集于2009年5—8月，張輝[22]研究樣本采集于2008年4月—2009年4月，本研究樣本采集于2017年9月，三者采樣時間最長間隔9年6個月，但三者研究結(jié)果均顯示，許氏平鲉的遺傳多樣性較高,說明近十年來大規(guī)模放流人工培育苗種尚未對許氏平鲉遺傳多樣性帶來較為明顯的影響。

3.2 許氏平鲉不同地理群體遺傳結(jié)構(gòu)差異分析

基因分化系數(shù)是反映群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)，基因分化系數(shù)在0～0.05之間變化，表明群體的遺傳分化較弱，為輕度遺傳分化[18]。本研究中，6個群體不同位點的基因分化系數(shù)為0.019～0.093，平均值為0.039，說明6個群體之間的遺傳分化較弱，與張輝[22]的研究結(jié)果一致。分子方差分析結(jié)果表明，主要的變異來源為群體內(nèi)個體間(3.975%)和個體間(93.078%)；而群體間變異所占比例較低，僅為2.947%。基因流與基因分化系數(shù)呈負(fù)相關(guān)，即基因流越大，群體間相似性越大，遺傳分化越小[14,18]。本研究各位點平均基因流為6.139，說明6個群體之間基因交流比較充分，群體間遺傳分化較小，與本研究中基因分化系數(shù)相關(guān)結(jié)果相互支持。群體之間充分的基因交流可能歸因于黃海暖流和中國沿岸流等海流驅(qū)動下的許氏平鲉仔稚魚隨漂流海藻團的擴散[22,26]。哈迪—溫伯格平衡檢驗結(jié)果顯示，5個群體15個位點顯著偏離哈迪—溫伯格平衡狀態(tài)(P<0.05)，這些位點多數(shù)表現(xiàn)出顯著的雜合子缺失，與王文琪等[17]的研究結(jié)果相似。

Nei氏遺傳距離構(gòu)建的非加權(quán)組平均法系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，北戴河群體獨立為1支，與其他群體的遺傳距離相對較大，與丹東、威海、日照分屬黃海、渤海2個海區(qū)且距離較遠(yuǎn)相符；丹東群體和威海群體先聚為1支，與丹東、威海距離較近且屬同一海區(qū)相符；這兩群體再與地處黃渤海交界的長島群體聚為1支，與3個群體距離較近相符；這3個群體再與日照群體聚為1支，與其距離相近或?qū)偻缓^(qū)基本相符。不同群體許氏平鲉遺傳分化結(jié)果與其所處的地理位置及其所在海區(qū)具有一定的相關(guān)性。但日照和營口分屬黃海、渤海2個海區(qū)，且距離較遠(yuǎn)，2個群體卻聚為1支，北戴河群體與營口群體同屬渤海海區(qū)且距離較近卻最后聚為1支。經(jīng)調(diào)查，營口群體采樣所在碼頭存在銷售外地漁獲物現(xiàn)象，推測可能因此導(dǎo)致營口群體與日照群體聚為1支，但具體原因有待進(jìn)一步研究。張輝[22]研究指出，分析的群體共享同一個基因庫，即所有個體屬于1個亞群，但是本試驗中所分析群體分為3個亞群，主要是因為本研究分析的群體包含了北戴河群體和營口群體，北戴河群體和其他幾個群體的遺傳相似性系數(shù)相對較低，遺傳距離相對較大。丁奎等[8]利用線粒體DNA控制區(qū)高變區(qū)片段對許氏平鲉野生群體和養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性對比，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖群體和野生群體之間以及養(yǎng)殖群體之間的遺傳分化較大，而野生群體間遺傳變異較小，其研究的野生群體組成與張輝[22]的研究結(jié)果基本相同。

4 結(jié) 論

根據(jù)本研究結(jié)果，結(jié)合歷史研究數(shù)據(jù)分析，目前黃海、渤海許氏平鲉的遺傳多樣性仍處于較高水平，暫未受到大規(guī)模放流人工培育苗種的影響。但為了降低大規(guī)模放流可能帶來的遺傳多樣性影響，筆者建議及時從放流地點附近海域捕撈野生許氏平鲉親本來更新放流用親魚，使放流親本保持較高的遺傳多樣性，進(jìn)而提高放流群體遺傳多樣性，其對漁業(yè)資源及生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。