李鍇 朱志輝

急性腎損傷是臨床上常見多發(fā)的疾病,其發(fā)病機制復(fù)雜,主要病理變化為腎小管上皮細胞凋亡，因此，減少腎小管上皮細胞凋亡可延緩急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展[1-2]。腎小管上皮細胞損傷時可合成和分泌炎性因子,而炎性因子反過來可加重急性腎損傷,抑制腎小管上皮細胞中炎性因子的產(chǎn)生是延緩急性腎損傷的有效方法[3-4]。隱花色素1(CRY1)屬于生物鐘基因家族,可調(diào)控小鼠晝夜節(jié)律,CRY1和CRY2的靶向突變延緩了p53無效突變小鼠的早期腫瘤形成[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，CRY1在大腸癌患者組織中異常表達,影響其總體生存率[6]。CRY1過表達減輕了小鼠模型中睡眠剝奪引起的血管炎癥[7]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路是MAPK的重要通路之一,介導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達,參與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,與腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8]。p38 MAPK信號通路的活化可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細胞內(nèi)炎性因子的表達[9]。抑制p38 MAPK信號通路活化可減輕腎小管上皮細胞凋亡及纖維化,發(fā)揮腎臟保護作用[10]。CRY1雖屬于生物鐘基因家族,但其也可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),但CRY1對腎小管上皮細胞凋亡的影響及其機制還尚未清楚。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種由單核巨噬細胞產(chǎn)生的可誘導(dǎo)細胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)的細胞活性因子,可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡[11]。本實驗通過用TNF-α誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡,研究CRY1基因?qū)NF-α誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響、機制及與p38MAPK信號通路的相關(guān)性。

材料與方法

1.材料：人腎小管上皮細胞HK-2購自上海名勁生物科技有限公司。胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibco公司；TNF-α購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸(BCA)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、CRY1、p-p38 MAPK和p38 MAPK等抗體均購自美國Abcam公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；CRY1干擾質(zhì)粒(si-CRY1)及其陰性對照質(zhì)粒(si-con)均購自北京源生思創(chuàng)生物科技有限公司。Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACS caliber流式細胞儀購自美國BD公司。

2.方法

(1)細胞培養(yǎng):人腎小管上皮細胞HK-2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2的恒溫箱,每2 d換液一次,當細胞融合至90%時用胰蛋白酶消化傳代。

(2)細胞轉(zhuǎn)染和分組：取對數(shù)生長期細胞無血清培養(yǎng)12 h后加入10 ng/ml的TNF-α分別培養(yǎng)0 h(0 h組)、12 h(12 h組)、24 h(24 h組)、48 h(48 h組),其中24 h組也為TNF-α組，以正常培養(yǎng)的細胞作為對照(NC)組。用50 μl無血清培養(yǎng)基稀釋1.0 μg的CRY1干擾質(zhì)粒(si-CRY1)及其陰性對照質(zhì)粒(si-con),輕輕混勻。將3 μl脂質(zhì)體用50 μl無血清培養(yǎng)基稀釋,輕輕混勻,室溫孵育5 min。將稀釋的si-con、si-CRY1質(zhì)粒和稀釋的脂質(zhì)體輕輕混合,室溫孵育20 min,形成脂質(zhì)體復(fù)合物。6 h后將復(fù)合物加入到含HK-2細胞和培養(yǎng)基中,震蕩培養(yǎng)板輕輕混合,在37 ℃ CO2孵箱中培養(yǎng)，分別記為si-con組及si-CRY1組。將si-con組、si-CRY1組細胞加入10 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)24 h,分別記為TNF-α+si-con組及TNF-α+si-CRY1組。轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行操作。

(3)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、CRY1、p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)蛋白表達水平：提取各組細胞蛋白,采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。各組細胞蛋白上樣量50 μg,經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上,5%脫脂牛奶室溫封閉90 min,加入一抗,于4 ℃孵育過夜,PBS洗滌3次,加入二抗室溫孵育2 h,PBS洗滌3次,暗室中曝光顯影,定影,將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理,測定各組蛋白條帶的灰度值,以目的條帶和肌動蛋白(β-actin)條帶的比值作為Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、CRY1、p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白表達水平。

(4)流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率：采用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各組細胞,然后離心收集細胞,PBS漂洗2次,加結(jié)合緩沖液重懸細胞。依據(jù)試劑盒說明書先后分別加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min。流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度,實驗重復(fù)3次。細胞凋亡率為AnnexinV+PI-和AnnexinV+PI+兩個象限的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例。

(5)ELISA檢測白細胞介素-1β(IL-1β)、干擾素γ(IFN-γ)及IL-6水平：收集各組細胞離心取上清液,按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IFN-γ、IL-6水平。

(6)實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測CRY1 mRNA表達水平：提取各組細胞RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR,每個樣品設(shè)3個重復(fù),循環(huán)條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s,共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達水平用2-△△Ct法計算。CRY1以β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增,CRY1上游引物序列：5’-CCGGCAGAAGTAACCTTTGA-3’,下游引物序列：5’-TAAGTCGCTTCGCATGTTTG-3’；β-actin上游引物序列：5’-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3’,下游引物序列：5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’。

結(jié) 果

1.不同時間點TNF-α對腎小管上皮細胞凋亡、炎癥因子及CRY1表達的影響：與0 h組相比，12 h、24 h、48 h組腎小管上皮細胞細胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Bax、CRY1表達水平顯著升高,Bcl-2表達水平降低、IL-1β、IFN-γ、IL-6水平顯著升高(P<0.05)。見圖1。

2.抑制CRY1表達對TNF-α誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡率和炎癥因子水平的影響：與si-con組相比,si-CRY1組腎小管上皮細胞凋亡率、CRY1、Cleaved caspase-3、Bax表達水平、IL-1β、IFN-γ、IL-6水平顯著降低,Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)。與NC組相比,TNF-α組腎小管上皮細胞凋亡率、CRY1、Cleaved caspase-3、Bax表達水平、IL-1β、IFN-γ、IL-6水平顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)。與TNF-α+si-con組相比,TNF-α+si-CRY1組腎小管上皮細胞細胞凋亡率、CRY1、Cleaved caspase-3、Bax表達水平、IL-1β、IFN-γ、IL-6水平顯著降低,Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

3.抑制CRY1表達對TNF-α誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞中p38 MAPK通路的影響：與si-con組相比,si-CRY1組腎小管上皮細胞中p-p38 MAPK表達水平顯著降低(P<0.05)；與NC組相比,TNF-α組腎小管上皮細胞中p-p38 MAPK表達水平顯著升高(P<0.05)；與TNF-α+si-con組相比,TNF-α+si-CRY1組腎小管上皮細胞中p-p38 MAPK表達水平顯著降低(P<0.05)。而p38 MAPK表達水平在各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

討 論

腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致急性腎損傷的主要原因[12]。研究發(fā)現(xiàn)，高水平的TNF-α可介導(dǎo)腎臟損傷和腎纖維化[13]，且TNF-α可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。因此,本實驗采用TNF-α處理腎小管上皮細胞,結(jié)果顯示TNF-α處理后12 h、24 h、48 h腎小管上皮細胞中Cleaved caspase-3、Bax表達水平顯著升高,Bcl-2表達水平顯著降低,細胞凋亡率顯著升高，說明TNF-α可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡。此外,本實驗還檢測了炎性因子水平,結(jié)果顯示,TNF-α處理的腎小管上皮細胞中IL-1β、IL-6及IFN-γ水平顯著升高。IL-1β、IL-6、IFN-γ均是促炎細胞因子,說明TNF-α可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。綜上,TNF-α可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生,說明腎小管上皮細胞損傷模型建立成功。

有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α增強了類風濕性滑膜細胞中CRY1 mRNA的表達水平[15]。CRY1是隱花色素家族成員之一,而隱花色素可通過上調(diào)促炎性細胞因子TNF-α的表達影響關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[16]。白藜蘆醇可通過靶向晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)劑CRY1預(yù)防丙烯酰胺誘導(dǎo)的肝細胞線粒體功能障礙和炎癥反應(yīng)[17]。抑制CRY1可通過抑制Toll樣受體(TLR)/核因子-κB(NF-κB)通路減輕慢性腎臟病大鼠的腎小球硬化和腎小管上皮損傷[18]。以上研究結(jié)果均表明CRY1與細胞炎性反應(yīng)有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示,TNF-α處理的腎小管上皮細胞中CRY1高表達,說明高CRY1可能與腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生有關(guān)。因此,本實驗為進一步研究CRY1對腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響,轉(zhuǎn)染CRY1的抑制表達載體si-CRY1至腎小管上皮細胞及TNF-α處理的腎小管上皮細胞中,然后檢測細胞凋亡情況、凋亡相關(guān)蛋白表達及炎性因子水平,結(jié)果顯示,腎小管上皮細胞中Cleaved caspase-3、Bax表達水平顯著降低,Bcl-2表達水平顯著升高,細胞凋亡率顯著降低,IL-1β、IFN-γ、IL-6水平顯著降低。說明抑制CRY1表達可抑制腎小管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌，并可減輕TNF-α誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌。本實驗結(jié)果提示抑制CRY1表達具有減輕腎小管上皮損傷的作用，與Liu等[18]的研究結(jié)果相符。

注：與0 h組比較,aP<0.05圖1 TNF-α誘導(dǎo)處理不同時間組腎小管上皮細胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白、CRY1表達水平和炎癥因子水平的比較(A：流式細胞術(shù)檢測不同時間組腎小管上皮細胞凋亡率；B：不同時間組細胞凋亡率比較；C：Western blot檢測不同時間組Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、CRY1表達水平；D：不同時間組Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、CRY1蛋白表達水平比較；E：不同時間組CRY1 mRNA表達水平比較；F：不同時間組炎癥因子IL-1β、IFN-γ、IL-6水平比較)

注：與si-con組比較,aP<0.05；與NC組比較,bP<0.05；與TNF-α+si-con組比較,cP<0.05圖2 抑制CRY1表達后TNF-α誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡率、cleaved cospase-3、Bax、Bcl-2蛋白、CRY1表達水平及炎癥因子水平比較(A：流式細胞檢測不同組別細胞凋亡率；B：不同組別細胞凋亡率比較；C：Western Blot檢測不同組別CRY1、cleaved cospase-3、Bax、Bcl-2表達水平；D：不同組別CRY1、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較；E：不同組別炎癥因子IL-1β、IFN-γ、IL-6水平比較)

注：與si-con組比較,aP<0.05；與NC組比較,bP<0.05；與TNF-α+si-con組比較,cP<0.05圖3 抑制CRY1表達后TNF-α誘導(dǎo)腎小管上皮細胞p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白表達水平比較(A：Western Blot檢測不同組別p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白表達結(jié)果；B：不同組別p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白表達水平比較)

研究發(fā)現(xiàn)抑制p38 MAPK信號通路可減輕缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)[19]，抑制p38 MAPK信號通路可減少腎小管上皮細胞凋亡[20]。說明p38 MAPK信號通路可能與炎性反應(yīng)及腎小管上皮細胞凋亡有關(guān)。本實驗為研究CRY1對腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)和凋亡的影響機制及與p38 MAPK信號通路的相關(guān)性,轉(zhuǎn)染CRY1的抑制表達載體si-CRY1至腎小管上皮細胞及TNF-α處理的腎小管上皮細胞中,然后檢測p-p38 MAPK及p38 MAPK蛋白表達水平,結(jié)果顯示,TNF-α處理的腎小管上皮細胞中p-p38 MAPK表達水平顯著升高,說明TNF-α激活了p38 MAPK信號通路。而抑制CRY1表達后,正常腎小管上皮細胞及TNF-α處理的腎小管上皮細胞中p-p38 MAPK表達水平均顯著降低,說明抑制CRY1表達可抑制p38 MAPK信號通路激活。CRY1可能通過抑制p38 MAPK信號通路激活抑制TNF-α誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

綜上,CRY1可抑制TNF-α誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌,其機制可能與p38 MAPK信號通路有關(guān)?？梢詾楸Ｗo腎小管上皮細胞損傷、減少腎損傷疾病的發(fā)生提供理論參考依據(jù)。