★嚴(yán)張仁 潘俊卿 胡香君 張思娜 申淑嫻 王萬(wàn)春

（1江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)外科 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南昌 330004）

前列腺炎（prostatitis）是前列腺在病原體或（和）某些非感染因素作用下，出現(xiàn)以骨盆區(qū)域疼痛或不適、排尿異常等癥狀為特征的一組疾病，好發(fā)于成年男性各年齡段，全球發(fā)病率高達(dá)10 %～15 %［1］。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）根據(jù)臨床表現(xiàn)將其分為：Ⅰ型:急性細(xì)菌性前列腺炎（ABP）；Ⅱ型:慢性細(xì)菌型前列腺炎（CBP）；Ⅲ型:慢性前列腺炎/慢性骨盆綜合征（CP/CPPS）；Ⅳ型:無(wú)癥狀型前列腺炎（AIP）［2］。病原體感染是Ⅰ、Ⅱ型前列腺炎主要致病因素；Ⅲ型前列腺炎病因發(fā)病機(jī)制尚不明確但可能與病原體感染、排尿功能異常、神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、免疫反應(yīng)異常及氧化應(yīng)激等因素相關(guān)［3］。前列腺炎根據(jù)分型可選擇采用抗生素、α受體阻滯劑、非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥等對(duì)癥治療和支持治療，但治療周期較長(zhǎng)，臨床療效欠佳，特別是Ⅱ、Ⅲ型前列腺炎，病情遷延難愈，反復(fù)發(fā)作，常伴有性功能障礙，焦慮，抑郁等癥狀，嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量。

前列腺炎屬中醫(yī)“精濁”“淋證”和“白濁”等范疇，中醫(yī)藥治療前列腺炎經(jīng)歷代醫(yī)家不斷的臨床實(shí)踐，對(duì)本病診治提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)，積累了眾多療效明確的中藥、方劑，如前列腺湯、解毒活血湯等。茯苓，味甘，淡，性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕，健脾，寧心的功效；澤瀉，味甘，淡，性寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕，泄熱，化濁降脂的功效。《傷寒論》中五苓散、豬苓湯、腎氣丸、茯苓澤瀉湯等方劑常使用茯苓、澤瀉相須配伍主治小便不利，淋證等前列腺疾病［4］。閔杰等［5］和孟明洋等［6］對(duì)中醫(yī)藥治療前列腺炎文獻(xiàn)挖掘發(fā)現(xiàn)“茯苓-澤瀉”藥對(duì)使用頻次較高。目前中醫(yī)藥防治前列腺炎研究多集中在炎癥代謝通路實(shí)驗(yàn)研究領(lǐng)域，而針對(duì)前列腺炎復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，缺乏利用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等新技術(shù)、新手段綜合探討中醫(yī)藥治療前列腺的相關(guān)機(jī)制研究［7］。本研究基于文獻(xiàn)挖掘的基礎(chǔ)上采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索“茯苓-澤瀉”藥對(duì)活性成分及藥效作用機(jī)制對(duì)前列腺炎的整體治療，分析“茯苓-澤瀉”多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同調(diào)控前列腺炎相關(guān)病理生理功能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分及潛在靶點(diǎn)檢索與篩選 在ETCM（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/）數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“茯苓”“澤瀉”中包含的化合物及化合物對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，并選取Druglikeness Weight≥0.3的化合物作為藥物活性成分。ETCM中化合物的類藥性評(píng)價(jià)采用的是Bickerton團(tuán)隊(duì)于2012年發(fā)表于Nature Chemistry的算法。靶標(biāo)預(yù)測(cè)采用的是MedChemStudio（3.0版）軟件。MedChemStudio是藥物相似性搜索軟件，用于查找與中藥成分具有高度結(jié)構(gòu)相似性（Tanimoto＞0.8）的已知藥物，從而進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)［8］。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)檢索 以“prostatitis”為關(guān)鍵 詞,分 別 在GeneCard（https://www.genecards.org/)、CTD(http://www.ctdbase.org/）數(shù) 據(jù) 庫(kù) 選 取Score≥30的靶點(diǎn)作為前列腺炎潛在作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)后并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://uniprot.org）中UniprotKB功能,物種設(shè)置為human,對(duì)篩選的靶點(diǎn)蛋白及基因進(jìn)行校正得到疾病靶點(diǎn)Genesymbol。

1.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 采用在線繪圖Omishare Tools平臺(tái)（http://www.omicshare.com/tools/）獲得“茯苓-澤瀉”藥對(duì)與前列腺炎共同靶點(diǎn)及Venn圖。共同靶點(diǎn)信息借助Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型并使用Network Analyzer插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.4 共同靶點(diǎn)功能分析 為明確共同靶點(diǎn)之間的相互作用，將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白相互作用（protein-protein interaction network,PPI network）網(wǎng)絡(luò)分析,并將PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并使用Network Analyzer插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，在DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）中對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO（Gene Ontology） 及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通 路 富 集 分 析，選 取P＜0.05且FDR＜0.05作為顯著功能與通路的臨界值，在Omishare Tools平臺(tái)繪制排名前20的KEGG通路氣泡圖，并將排名前20的GO分析中生物學(xué)過(guò)程按PValue值大小列出。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及潛在靶點(diǎn)、疾病相關(guān)靶點(diǎn) 從ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出茯苓活性成分31個(gè)，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)231個(gè)；澤瀉活性成分22個(gè)，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)251個(gè)。檢索出疾病相關(guān)靶點(diǎn)633個(gè)。茯苓-澤瀉藥對(duì)與前列腺炎同有靶點(diǎn)22個(gè)，茯苓對(duì)前列腺炎特有調(diào)控靶點(diǎn)13個(gè)；澤瀉對(duì)前列腺炎特有調(diào)控靶點(diǎn)28個(gè)。詳見(jiàn)圖1和表1。

圖1 “茯苓-澤瀉”藥對(duì)與前列腺炎靶點(diǎn)交集Venn圖

表1 “茯苓-澤瀉”藥對(duì)與前列腺炎靶點(diǎn)交集

2.2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，如圖2，共得到119個(gè)節(jié)點(diǎn)，590條邊，53個(gè)中藥活性成分，共同參與調(diào)節(jié)63個(gè)前列腺炎相關(guān)靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)平均連接度為9.916，中位數(shù)為7，定義網(wǎng)絡(luò)中連接度大于或等于10 的節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點(diǎn)，核心節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)性強(qiáng)，具有更大的影響，在網(wǎng)絡(luò)中更重要。核心成分節(jié)點(diǎn)33個(gè)，茯苓24個(gè)，澤瀉8個(gè)；核心靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)15個(gè)。連接度最高活性成分的前5個(gè)為13?’,17?’-epoxyalisol A、dehydroeburicoic acid、eburicoic acid、3?’-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid、trametenolic acid、dehydroabietic acid methyl ester，說(shuō)明這些成分可以同時(shí)調(diào)控較多的靶點(diǎn)，可能在藥物治療疾病中發(fā)揮較高的作用；核心靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)前10為NR3C1，AR，HSD3B1，PGR，VDR，ESR1，NCOA1，RXRA，HDAC2，COX5B，說(shuō)明這些靶點(diǎn)可能受到藥物作用較強(qiáng)，在藥物治療疾病中更突出。

從圖2總體可以看出，茯苓-澤瀉通過(guò)多種活性成分，共同調(diào)節(jié)多個(gè)多疾病相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮藥效作用。

圖2 茯苓-澤瀉藥物成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（箭頭表示靶點(diǎn)，紅色為藥對(duì)共同靶點(diǎn)，綠色箭頭為澤瀉特有調(diào)控靶點(diǎn)，紫色箭頭為茯苓特有調(diào)控靶點(diǎn)；矩形表示活性成分；節(jié)點(diǎn)大小與連接度成正比）

2.3 共同靶點(diǎn)功能分析 對(duì)63個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，有62個(gè)共同靶點(diǎn)之間相互關(guān)聯(lián)存在互作關(guān)系，共583條邊，平均連接度為18.806，表明共同靶點(diǎn)之間通過(guò)583個(gè)相互作用關(guān)系緊密相互作用調(diào)控62個(gè)疾病靶。PPI網(wǎng)絡(luò)分析提示AKT1、STAT3、ESR1、CASP3、CCND1、AR、SRC、TNF、MDM2、PTGS2等靶點(diǎn)相互作用更強(qiáng)，可能是發(fā)揮治療作用的重要靶點(diǎn)，而TNF、PTGS2是炎癥通路中重要的靶點(diǎn)之一，見(jiàn)圖3。

對(duì)63個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析及KEGG富集分析,得到生物過(guò)程（biological proces，BP）12個(gè)、細(xì)胞組分（cellular component，CC）1個(gè)，分子功能（molecular function，MF）6個(gè)，KEGG信號(hào)通路39條，排名前30條通路，見(jiàn)圖4。共同靶點(diǎn)功能分析結(jié)果顯示共同靶點(diǎn)主要GO分析涉及RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始，RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄與翻譯是疾病基因表達(dá)的重要生物學(xué)過(guò)程。KEGG功能分析涉及前列腺癌、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞周期、P53信號(hào)通路、生成信號(hào)通路、EB病毒感染等，其中腫瘤壞死因子信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路在炎癥中發(fā)揮重要作用。由此看出，茯苓-澤瀉可以通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)生物途徑，多個(gè)生物信號(hào)通路發(fā)揮治療前列腺炎的作用機(jī)制。

圖3 共同靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（黃色圓圈表示連接度Degree≥20的節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)大小與連接度成正比）

圖4 共同靶點(diǎn)GO分析和KEGG富集分析前30氣泡圖

3 討論

細(xì)菌性前列腺炎是在機(jī)體抵抗力降低時(shí)病原體，尤其是革蘭陰性菌中大腸埃希菌感染腺體，引起前列腺組織出現(xiàn)充血、水腫，腺泡或間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤(rùn)，甚至形成小膿腫，進(jìn)而出現(xiàn)泌尿系感染等癥狀［9］。非細(xì)菌性前列腺炎尤其是Ⅲ型前列腺病因病機(jī)尚不明確，目前認(rèn)為：（1）排尿功能異常：尿液反流使尿液中尿酸、肌酐等刺激前列腺誘發(fā)疼痛，且尿酸沉積導(dǎo)致前列腺組織炎癥［10］；（2）免疫功能失調(diào)：免疫抑制細(xì)胞功能降低，促炎及抗炎介質(zhì)失衡，尤其是Th1/Th2細(xì)胞、Th17/Treg細(xì)胞比例失衡［11-12］；（3）氧化應(yīng)激：氧自由基持續(xù)作用導(dǎo)致前列腺發(fā)生缺氧，導(dǎo)致水腫及纖維化或支配前列腺的神經(jīng)受損［13］；（4）神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂：疼痛物質(zhì)P、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerver growth factor，NGF）等細(xì)胞因子誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)L5-S2節(jié)段脊髓神經(jīng)功能障礙［13］；（5）其他，骨盆相關(guān)疾病、精神心理因素均與前列腺炎發(fā)生相關(guān)。目前針對(duì)前列腺炎的治療十分局限且療效一般，發(fā)現(xiàn)具有靶向性的活性成分是精準(zhǔn)治療前列腺炎的新方向。

本研究篩選的茯苓主要成分為茯苓酸，三萜類成分。研究表明茯苓三萜化合物具有利尿作用［14］，因而減輕前列腺炎排尿異常反應(yīng)，茯苓三萜成分對(duì)急、慢性炎癥均有抑制作用［15］。茯苓辛酸C對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制作用并通過(guò)下調(diào)核因子NF-κB來(lái)抑制iNOS和COX-2表達(dá)從而發(fā)揮抗炎作用［16］。茯苓酸通過(guò)減弱白細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附,抑制腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)量分泌,阻止過(guò)多白細(xì)胞到達(dá)炎癥部位和過(guò)度炎癥反應(yīng),發(fā)揮抗炎作用［17］；茯苓酸是一種新的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，能有效抑制DNA聚合酶的活性，使細(xì)胞停留在G1期，抑制細(xì)胞水腫及纖維化［18］。三萜類成分也是澤瀉發(fā)揮藥理活性的主要成分，具有抗炎、抗菌、利尿等作用［19］。本研究篩選出三萜類13個(gè)，倍半萜5個(gè)，澤瀉主要通過(guò)三萜類和倍半萜發(fā)揮成分發(fā)揮治療作用。澤瀉三萜能抑制toll樣受體4（TLR4）/NADPH氧化酶2（NOX2）信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用［20］；Alisol B 23-acetate作用PI3K-AKT信號(hào)通路［21］。澤瀉總?cè)瓶梢詼p少炎癥介質(zhì)的釋放，抑制急性炎癥對(duì)炎癥造成的組織增生有抑制作用［22］。因此，茯苓-澤瀉藥對(duì)主要通過(guò)茯苓三萜類成分，澤瀉三萜類和澤瀉倍半萜成分發(fā)揮治療前列腺炎的作用。

中藥治療疾病具有多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)，靶點(diǎn)之間相互作用，組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系。共同靶點(diǎn)PPI分析，生物功能分析和通路富集結(jié)果顯示AKT1、STAT3、ESR1、TNF、MDM2、PTGS2、PGR、NFKB1、HIF1A、MAPK14、PIK3CA、IL1B等是關(guān)鍵靶點(diǎn)；蛋白激酶活性、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始，正負(fù)調(diào)控，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等是關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程；前列腺癌、PI3KAkt信號(hào)通路、細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、FOxO信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路是關(guān)鍵的信號(hào)通絡(luò)。MAPK14在由促炎細(xì)胞因子或者物理刺激等細(xì)胞外刺激所引發(fā)的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起重要作用；TNF、IL1B是一些炎癥病理生理反應(yīng)最重要的調(diào)節(jié)因子；PTGS2在機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著十分重要的作用，主要功能之一就是催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素E2，廣泛參與機(jī)體多個(gè)組織和器官的炎癥反應(yīng)。TNF、Toll樣受體信號(hào)通路信號(hào)通路與炎癥免疫調(diào)控，氧化損傷相關(guān)［23］；HIF-1 信號(hào)通路在炎癥因子調(diào)控及低氧濃度或缺氧應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的；PI3K-AKT信號(hào)通路在某些病毒復(fù)制過(guò)程中必須激活。本研究結(jié)果表明，茯苓-澤瀉可能作用于TNF、MDM2、PTGS2、PGR、NFKB1、MAPK14等的多個(gè)靶點(diǎn)，作用于PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、FOxO信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路TNF、等多個(gè)信號(hào)通路，調(diào)控RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始，正負(fù)調(diào)控，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性治療前列腺炎。

綜上所述，“茯苓-澤瀉”藥對(duì)相須配伍，主要通多其三萜類成分調(diào)節(jié)TNF、PTGS、NFKB1、MAPK14等靶點(diǎn)，促進(jìn)RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始，正負(fù)調(diào)控，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，調(diào)控PI3K-Akt、TNF、HIF-1、Toll樣受體信號(hào)通路等參與組織的抗炎、氧化應(yīng)激等生物學(xué)修復(fù)過(guò)程。茯苓-澤瀉多成分，共同參與調(diào)節(jié)到前列腺的多個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)中，協(xié)同參與相關(guān)信號(hào)通路綜合改善前列腺的病理生理過(guò)程。值得注意的是目前中藥主要成分提取及其類藥性研究仍然不足，重要成分靶點(diǎn)多建立在計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)和既有藥物研究基礎(chǔ)上的比對(duì)，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)在疾病中發(fā)揮的機(jī)制仍需基礎(chǔ)研究來(lái)驗(yàn)證。因此，本研究仍需進(jìn)一步的中藥藥理實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。