楊涵羽璐，楊永林，方晨輝，楊 華*，沈 敏，楊井泉，高 磊

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；3. 新疆農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；4. 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

【研究意義】毛囊是皮膚重要的附屬器官，是羊毛生長發(fā)育及羊毛品質(zhì)的基礎(chǔ)，毛囊發(fā)育影響著細度、密度、強度和長度等羊毛重要的經(jīng)濟性狀，決定羊毛的質(zhì)量?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，毛囊由8個獨特的細胞群構(gòu)成，是哺乳動物中最典型也是最復雜的微小器官之一，也是哺乳動物唯一具有生命周期的生長器官[1-4]。毛囊發(fā)育始于胚胎期的外胚層和中胚層，胎兒期的毛囊發(fā)育對出生后的羊毛發(fā)生、發(fā)育都有影響。因此，研究胎兒期毛囊發(fā)育的形態(tài)特征與分化結(jié)構(gòu)變化可為細毛羊的選育奠定基礎(chǔ)。毛囊發(fā)育中，許多信號通路相互作用參與了毛囊周期交替，真皮和表皮細胞群之間相互作用產(chǎn)生了毛囊[5]。毛囊在胚胎發(fā)育后期發(fā)生，不同毛囊的功能和基因表達不同，毛囊分為初級毛囊(PF)和沒有汗腺的次級毛囊(SF)，次級毛囊決定羊毛品質(zhì)和產(chǎn)量[6]。Galbraith和Rogers研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊胚胎發(fā)育50 d左右時，皮膚逐漸開始形成初級毛囊，次級毛囊在胚胎發(fā)育到85 d時開始出現(xiàn)，到羔羊出生時，所有毛囊都已形成，初級毛囊雖然都已經(jīng)成熟，但次級毛囊尚未成熟[7-8]。中國超細毛羊(甘肅型)在胎兒期84 d時初級毛囊在皮膚一側(cè)開始發(fā)生[9]。【本研究切入點】中國美利奴羊(新疆軍墾型)是利用澳洲美利奴公羊作為父本，波爾華斯羊與新疆細毛羊作為母本，采取級進雜交的方法于1972年在新疆紫泥泉種羊場培育成功。該品種羊毛的毛叢結(jié)構(gòu)閉合良好，各部位毛纖維長度與細度均勻，羊毛細度為60～64支以上，所產(chǎn)的羊毛是經(jīng)濟價值非常高的天然紡織原料。而針對中國美利奴羊(新疆軍墾型)初級毛囊和次級毛囊發(fā)育的時間點及形態(tài)變化特征報道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文研究中國美利奴羊(新疆軍墾型)11個胎兒期毛囊發(fā)育形態(tài)結(jié)構(gòu)變化與發(fā)育規(guī)律，分析毛囊特征參數(shù)與毛性狀間的相關(guān)性，為優(yōu)質(zhì)超細毛羊的培育工作提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇新疆農(nóng)墾科學院種羊場50只2.5歲健康的中國美利奴羊(新疆軍墾型)經(jīng)產(chǎn)母羊(平均羊毛纖維直徑為17.5±0.5 μm)，在相同的飼養(yǎng)管理條件下喂養(yǎng)，嚴格執(zhí)行防疫和驅(qū)蟲。根據(jù)種羊系譜信息，應(yīng)用同品種的種公羊(平均羊毛纖維直徑16.6±0.5 μm)配種，準確記錄配種時間。采樣時間從2017年9月15日至2018年3月1日，以胎兒發(fā)育的45 d開始，每10 d為1個采樣期，分別為45 d(第1時期)、55 d(第2時期)、65 d(第3時期)、75 d(第4時期)、85 d(第5時期)、95 d(第6時期)、105 d(第7時期)、115 d(第8時期)、125 d(第9時期)、135 d(第10時期)和145 d(第11時期)，每個發(fā)育時期采集3只胎羊的體側(cè)部皮膚組織，共33個胎兒，皮膚組織用1×PBS洗滌，放入4 %多聚甲醛保存，備用。

1.2 主要儀器設(shè)備

RM2235石蠟切片機(Leica，德國)，恒溫水浴槽，石蠟包埋冷臺(EG1130)，染片機(Leica CV5030)，自動封片機(Leica)，正置顯微鏡(Nikon)，切片架，烘干箱等。

1.3 主要試劑

試劑均為分析純，無水乙醇、二甲苯、多聚甲醛、蘇木素染液、伊紅染液(北京索萊寶科技)；專用包埋石蠟(上海華靈)；中性樹脂。

1.4 試驗方法

1.4.1 石蠟組織切片制作 將采集的各個時期的皮膚組織修剪為1 cm2的小方塊，用1×PBS沖洗，然后放入4 %多聚甲醛內(nèi)固定 24 h 以上。將固定好的組織塊修整后，用1×PBS緩沖液沖洗，經(jīng)過不同濃度乙醇梯度脫水。用二甲苯透明處理，浸蠟，石蠟包埋。將包埋好的蠟塊放到切片機上，根據(jù)毛囊生長方向，切為5 um的橫切和縱切組織切片，隨后用烘片機烘干切片的水分，固定1 h后取出，放在切片架上37 ℃干燥。應(yīng)用蘇木精和伊紅進行HE染色。

1.4.2 統(tǒng)計方法 在顯微鏡下觀察皮膚毛囊組織切片，根據(jù)切片比例尺計算視野面積，計算總毛囊數(shù)、初級毛囊密度、次級毛囊密度、次級毛囊密度/初級毛囊密度比值(S/P)。用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胎兒皮膚發(fā)育變化

從圖1-A～B可見，毛囊在胚胎時期開始形成，從毛囊原始體發(fā)育形成一套完整的不斷產(chǎn)生羊毛纖維的毛囊組織，毛囊和胎兒皮膚細胞同時發(fā)育。胎兒45～55 d是皮膚發(fā)育的時期，皮膚明顯地分為表皮層、真皮層、皮下結(jié)締組織3層。

2.2 毛囊形態(tài)發(fā)生變化

從圖1-C～K可見，在胎兒發(fā)育65 d時，出現(xiàn)毛囊原始體，隨著細胞大量增殖，在毛囊原始體的部位出現(xiàn)一個囊泡，然后開始向真皮層伸入生長。到胎齡85 d時，毛囊從真皮層一直延伸到皮下結(jié)締組織。汗腺和皮脂腺等附屬物也逐漸形成，開始出現(xiàn)立毛肌的組織。管狀物中充滿了生長細胞，形成毛原錐體，其一側(cè)出現(xiàn)皮脂腺和汗腺，汗腺向下直達皮膚最下層。立毛肌發(fā)育成熟，一端連接在發(fā)生發(fā)層上，另一端深入毛囊下部。管狀下端與毛乳頭相聯(lián)結(jié)，細胞不斷增殖而膨大，包圍毛乳頭，形成毛球。次級毛囊開始發(fā)生，排列在初級毛囊周圍(圖1-E)。原始次級毛囊(SO)在初級毛囊(PF)附近以及初級毛囊之間開始形成。胎齡105 d時，次級毛囊和初級毛囊之間派生出再分化次級毛囊(SD)。毛纖維最后穿過表皮伸出體外，形成毛管(圖1-G)。初級毛囊周圍會出現(xiàn)原始的次級毛囊和再分化次級毛囊，形成線性三毛囊群(PLX)(圖1-H)。從115～145 d毛囊的橫切面可以看出，皮脂腺和汗腺都可以與中央毛囊群(PCX)相關(guān)聯(lián)。最早發(fā)育的次級毛囊出現(xiàn)在離初級毛囊最遠的毛囊群周圍，而最近的次級毛囊往往出現(xiàn)在中央初級毛囊之間。

A:胎兒期45 d(400×)； B：胎兒期55 d(200×)； C：胎兒期65 d(200×)； D：胎兒期75 d(200×)； E：胎兒期85 d(200×)； F：胎兒期95 d(400×)； G：胎兒期105 d(100×)； H:胎兒期115 d(100×)。a1:表皮；a2：皮下結(jié)締組織；b1：表皮；b2：真皮；b3：皮下結(jié)締組織；c：囊泡；d：毛芽；e1：初級毛囊；e2：次級毛囊；f1：毛球 f2：初級毛囊；f3：次級毛囊；g1：毛管；g2：外根鞘；g3：毛干；g4：真皮毛乳頭；h1：連接組織鞘；h2：真皮毛乳頭；h3：毛球；h4：再分化次級毛囊A：45 days of fetal period(400×); B: 55 days of fetal period(200×); C: 65 days of fetal period(200×); D: 75 days of fetal period(200×); E: 85 days of fetal period(200×); F: 95 days of fetal period(400×); G: 105 days of fetal period(100×); H: 115 days of fetal period(100×). a1: Epidermis; a2: Subcutaneous connective tissue; b1: Epidermis; b2: Dermis; b3: Subcutaneous connective tissue;c: Epidermis plug; d: Hair germ; e1: Primary follicle; e2: Secondary follicle; f1: Hair bulb; f2: Primary follicle; f3: Secondary follicle;g1: Hair canal;g2: Outer root sheath; g3: Hair shaf; g4: Dermal papilla; h1: Connective tissue sheath; h2:Secondary follicle; h2: Dermal papilla; h3: Hair bulb; h4: Re-differentiation secondary follicle圖1 11個胎兒期皮膚毛囊形態(tài)發(fā)生變化(縱切)Fig.1 Morphology changeable process of skin hair follicle in 11 fetal periods

2.3 毛囊密度與S/P值計算

通過胎兒期85～115 d橫切切片圖(圖2)可見，隨著次級毛囊的發(fā)生，原始次級毛囊會再分化次級毛囊，次級毛囊數(shù)量越來越多，再分化次級毛囊會決定后期毛囊數(shù)目，繼而影響毛性狀經(jīng)濟價值。隨著毛囊發(fā)育毛囊會逐漸增大。進一步統(tǒng)計次級毛囊與初級毛囊密度，表1為統(tǒng)計分析的胎兒期85～145 d毛囊密度及S/P值，可見初級毛囊密度隨著胎齡的先增加后減小，初級毛囊密度在95 d最大。

表1 胎兒期85～145 d毛囊密度及S/P值Table 1 Hair follicle density and S/P ratio from 85 to 145 days fetus

次級毛囊密度隨著胎齡的增長也呈先增加后減小，次級毛囊密度在115 d最大。次級毛囊數(shù)量/初級毛囊數(shù)量(S/P)值隨著發(fā)育階段逐漸增大，在135 d時S/P值達到最大值4.45。

3 討 論

毛發(fā)是哺乳動物的典型特征，具有調(diào)節(jié)體溫、保護和偽裝等功能。毛發(fā)是由皮膚的外胚層分化形成，此外還形成了皮脂腺、汗腺和指甲等附屬物結(jié)構(gòu)[5]。對于綿羊來說，除了提供保護，羊毛也有感官功能，在皮膚水平上延伸觸覺的發(fā)生[10]。羊毛是一種重要的動物產(chǎn)品，是紡織工業(yè)的原材料。羊毛的質(zhì)量取決于它的纖維直徑(細度)、卷曲度、長度、顏色等。其中，纖維直徑是決定羊毛品質(zhì)和價格的最重要因素。作為羊毛生長的直接器官，毛囊對生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羊毛起著至關(guān)重要的作用，而且毛囊能夠在不同季節(jié)改變類型和密度[11]。羊毛次級毛囊的生長周期和復雜的結(jié)構(gòu)影響羊毛的生長發(fā)育和羊毛品質(zhì)。

許多研究人員對毛囊形態(tài)學進行了研究，許竟武等通過組織切片證實湖羊在胎齡66 d時體側(cè)部出現(xiàn)初級毛囊原始體，到胎齡95 d時發(fā)育完全，此時次級毛囊原始體才開始出現(xiàn)，到132 d 時初級毛囊和次級毛囊均已發(fā)育完全[12]。灘羊在45～50 d胎兒期的時候頭部毛囊原始體開始出現(xiàn)，60 d時毛囊原始體開始發(fā)展到全身，到105 d時毛纖維已生長出體外[13]。蘇博美利奴羊皮膚初級毛囊約在胚胎 50～55 d 開始形成，胎齡 65～75 d 是初級毛囊形成的重要時期，胎齡 80～85 d 是次級毛囊形成期，胎齡 105～135 d 是次級毛囊大量再分化時期[14]。

Gao等通過對絨山羊毛囊形態(tài)學變化表明，初級毛囊在胎齡60 d開始發(fā)育，到胎齡120 d成熟，而在胎齡120 d鑒定出次級毛囊的分化，直到出生后羊毛形成[15]。張燕軍等通過觀察內(nèi)蒙古阿爾巴斯絨山羊胚胎皮膚組織切片，發(fā)現(xiàn)絨山羊的毛囊由連接組織鞘(CTS)、外根鞘(ORS)、內(nèi)根鞘(IRS)、毛球和毛干等組成，在胎齡55～65 d時，毛芽開始形成，胎齡135 d時，大多數(shù)初級毛囊和一部分次級毛囊分支發(fā)育基本成熟[16]。阿拉善絨山羊胎兒皮膚石蠟切片觀察表明，胎兒期45 d時初級毛囊發(fā)生，75 d時次級毛囊發(fā)生，同時皮脂腺和汗腺等附屬物出現(xiàn)，豎毛肌在90 d出現(xiàn)，初級毛囊在胎兒135 d時發(fā)育完成，次級毛囊到出生后6月齡發(fā)育完成。林吉茂等運用HE和Masson染色法以及透射電鏡觀察不同發(fā)育時期的山羊胎兒皮膚組織切片，結(jié)果顯示，胎齡8～9周表皮開始發(fā)育，10周胎齡真皮層開始出現(xiàn)，11周胎齡原始毛囊出現(xiàn)，12～13周胎齡表皮細胞出現(xiàn)角質(zhì)層、透明層及顆粒層的分化，汗腺開始出現(xiàn)；14～15周胎齡毛球上皮細胞開始分化為外根鞘、內(nèi)根鞘和毛發(fā)的前體，在毛囊旁可見附屬物皮脂腺；16～17周胎齡毛開始形成，并隨著發(fā)育逐漸長出體表；18周胎齡皮膚結(jié)構(gòu)逐漸趨于成熟[17]。以上研究結(jié)果說明，綿羊的初級毛囊原始體在胎齡45～66 d出現(xiàn)，胎齡 65～75 d是初級毛囊形成期，胎齡 80～95 d 是次級毛囊形成期，胎齡 105～135 d 是次級毛囊再分化時期。

山羊的初級毛囊原始體在胎齡45～65 d出現(xiàn)，胎齡60～75 d是初級毛囊形成期，胎齡75～135 d到是次級毛囊發(fā)育期，胎齡120 d到出生是次級毛囊再分化時期?？梢?，綿羊和山羊由于品種不同，毛囊發(fā)育節(jié)點差異較大。

本研究通過制作中國美利奴羊(新疆軍墾型)胎兒期45～145 d皮膚毛囊不同發(fā)育時期的石蠟切片，分析皮膚毛囊發(fā)育的組織形態(tài)學特征，探究毛囊的發(fā)生及發(fā)育的細微過程。結(jié)果表明，皮膚結(jié)構(gòu)在45～55 d逐漸發(fā)育完成，形成表皮層、真皮層、皮下結(jié)締組織3層。

在胎兒發(fā)育過程中，毛纖維發(fā)育首先在皮膚的生發(fā)層出現(xiàn)一個結(jié)點，周圍的血管為其輸送血液和營養(yǎng)，細胞開始迅速分裂增殖，在65 d出現(xiàn)毛囊原始體，隨著細胞大量增殖，毛囊原始體的部位出現(xiàn)囊泡，然后開始向真皮層伸入生長，初級毛囊開始發(fā)育。到胎齡85 d時，毛囊從真皮層一直延伸到皮下結(jié)締組織，次級毛囊開始發(fā)育。胎齡105 d時，次級毛囊開始分化，出現(xiàn)再分化次級毛囊。毛球細胞持續(xù)增殖，管狀邊沿的細胞不斷聚集而形成毛鞘，中間的則形成毛根，并開始角質(zhì)化。毛鞘內(nèi)的細胞急劇增殖，毛原錐體從毛鞘生長層連續(xù)的向上生長，而逐漸角質(zhì)化。角質(zhì)化后細胞形成的各種形狀細胞，形成毛纖維。次生毛囊此時以形成了許多分支。新生的角質(zhì)化細胞不斷生長，新長成的羊毛纖維開始向上生長，加之有規(guī)律的毛囊周期性運動，毛纖維最后穿過表皮伸出體外，即形成了毛管。

115～145 d毛囊的橫切面可以看出皮脂腺和汗腺都可以與中央毛囊群(PCX)相關(guān)聯(lián)。盡管一些毛囊兩個形成一對或保留為孤立的毛囊。因此，最早發(fā)育的次級毛囊出現(xiàn)在離初級毛囊最遠的毛囊群周圍，而最近的次級毛囊往往出現(xiàn)在中央初級毛囊之間。

本研究表明，中國美利奴羊(新疆軍墾型)的毛囊原始體、初級毛囊、次級毛囊和再分化次級毛囊發(fā)育時間處于已報道的毛囊發(fā)育時間范圍，而具體的發(fā)育時間差異可能是由于不同品種或者相同品種不同品系，以及生長環(huán)境、營養(yǎng)水平等原因?qū)е陆Y(jié)果不同。

次級毛囊數(shù)量/初級毛囊數(shù)量(S/P)的比值是反映羊毛纖維直徑的重要指標。在細毛羊選育工作中，選擇S/P值大的個體，不但能夠使產(chǎn)毛量提高，還能夠增加羊毛長度、減小羊毛細度，有助于同時提高產(chǎn)毛量和羊毛品質(zhì)。史雷等通過制作陜北白絨山羊皮膚組織切片，觀察皮膚毛囊形態(tài)特征，統(tǒng)計分析皮膚和毛囊的特征參數(shù)，S/P值與產(chǎn)絨量呈極顯著正相關(guān)，與絨細度呈顯著負相關(guān)，與絨長度呈顯著正相關(guān)；次級毛球?qū)挾扰c產(chǎn)絨量、絨長度呈極顯著正相關(guān)[18]。澳大利亞美利奴羊的S/P高于中國超細毛羊(甘肅型)，然而中國超細毛羊(甘肅型) S/P值高于甘肅高山細毛羊[19]。中國超細毛羊(甘肅型)初級毛囊密度在胎齡87 d 時最大，隨著胎齡的增加而逐漸減小；次級毛囊密度在胎齡87～117 d 時逐漸增加,在117 d時為(232.8±12.44)個/mm2達到最大值，然后逐漸減小，從138 d至出生時基本穩(wěn)定；S/P 比值在87～126 d 時逐漸增大,在126 d時達到最大值9.96之后開始減小，到出生時基本穩(wěn)定。本研究中S/P值隨著胎齡的增加而逐漸增大，在135 d達到最大值，隨后在145 d時出現(xiàn)一個下降。

綜上所述，不同品種、同一品種不同品系、不同飼養(yǎng)條件、飼養(yǎng)管理、飼草料組成是造成的初級毛囊、次級毛囊和再分化次級毛囊發(fā)育時間，以及S/P值出現(xiàn)差異的原因。在細毛羊育種中，S/P值可以作為細毛羊選種工作中的一個重要性狀指標，注重皮膚毛囊性狀參數(shù)與產(chǎn)毛性狀參數(shù)的相關(guān)性分析。

4 結(jié) 論

通過對中國美利奴羊(新疆軍墾型)胎兒11個發(fā)育時期皮膚毛囊組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)學觀察，胎齡 55 d時皮膚已經(jīng)形成了完整的結(jié)構(gòu)，毛囊原始體于65 d逐漸形成，初級毛囊開始發(fā)生的時期；胎齡85 d 次級毛囊開始發(fā)生。胎齡 105 d 時在原始次級毛囊開始再分化出次級毛囊。初級毛囊密度隨著胎齡的增長而減小，次級毛囊密度隨著胎齡的增長而增大。胎兒期85～145 d的S/P值隨著胎齡的增加而逐漸增大。