黃振東, 蒲占湑, 胡秀榮, 陳國(guó)慶, 呂 佳, 朱 莉

(浙江省柑橘研究所, 浙江臺(tái)州 318020)

柑橘黃龍病(huanglongbing)是目前世界上最具破壞性的柑橘病害。亞洲柑橘木虱Diaphorinacitri為刺吸式口器害蟲，是柑橘黃龍病菌傳播的媒介昆蟲，在全球廣泛分布，主要危害柑橘Citrusreticulata、橙Citrussinensis、柚Citrusmaxima、九里香Murrayapaniculata等蕓香科(Rutaceae)植物，其通過(guò)在新梢、嫩芽和幼葉上吸食汁液進(jìn)行為害。亞洲柑橘木虱可以攜帶黃龍病病原體，帶菌亞洲柑橘木虱取食健康橘樹時(shí)，病原體通過(guò)口針進(jìn)入植株內(nèi)，在植株內(nèi)定居、繁殖，受害的植株葉片均勻黃化，脈間葉肉似缺鋅狀黃化，節(jié)間短，后期枝干枯死，果實(shí)小并畸形，根多腐爛，甚至全株枯死。因此，亞洲柑橘木虱的有效防治是切斷柑橘黃龍病傳播蔓延的重要途徑(Xuetal., 1988; Pelz-Stelinskietal., 2010)。

為明確媒介昆蟲傳播植物病原的機(jī)理和昆蟲在寄主植物上的定殖、發(fā)育行為和寄主適應(yīng)性，需要研究其在寄主植物的取食機(jī)制。McLean和Kinsey在1964年開發(fā)了昆蟲在植物組織中口針穿透和吸入活性的記錄儀器(McLean and Kinsey, 1964)，可用于刺吸式口器昆蟲的取食行為研究，該儀器將昆蟲和植物建立電子回路，不同的刺吸行為會(huì)產(chǎn)生各種典型的電壓波動(dòng)(波形)，采用相應(yīng)的技術(shù)定位其刺吸位置(組織學(xué))或者攝取信號(hào)、排出或分泌唾液等，該技術(shù)稱為刺吸電位技術(shù)(electrical penetration graph, EPG)。一般昆蟲在刺吸過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生非常小的電勢(shì)差，這種電勢(shì)差通過(guò)信號(hào)放大器放大才能顯示出來(lái)，昆蟲從刺吸到取食過(guò)程的電勢(shì)不同，會(huì)顯示不同的波形，根據(jù)波形判斷是在取食還是其他行為(李靜靜等, 2019)。大部分的植食性刺吸式口器昆蟲都可以通過(guò)刺吸電位技術(shù)記錄其刺吸行為，如木虱科、粉虱科、蚜蟲科等。采用直流電系統(tǒng)根據(jù)亞洲柑橘木虱在植物軟組織和表皮的刺吸路徑相關(guān)DC-EPG信號(hào)分別定義了其主要的取食波形(Bonanietal., 2010; 楊成良等, 2011; 烏天宇等, 2020)。

以石油為原料的園藝礦物油(horticultural mineral oil, HMO)乳劑對(duì)亞洲柑橘木虱、柑橘潛葉蛾P(guān)hyllocnistiscitrella、二斑葉螨Tetranychusurticae、柑橘盾蚧類包括紅圓蚧Aonidiellaaurantii、牡蠣蚧Lepidosaphesbeckii和柑橘粉虱Aleurocanthussp.均有良好的防治效果(Liuetal., 2002; Leongetal., 2012)。HMO價(jià)格比一些合成農(nóng)藥便宜，對(duì)橘園有益昆蟲的毒性也低于合成農(nóng)藥，而且至今未見到對(duì)柑橘害蟲的抗藥性報(bào)道，該產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)國(guó)際有機(jī)物資審查機(jī)構(gòu)評(píng)審用于有機(jī)柑橘生產(chǎn)(Stansly and Tansey, 2015)。Rae等(1997)報(bào)道HMO對(duì)于亞洲柑橘木虱有一定的抑制效果，隨著HMO濃度的提高，亞洲柑橘木虱在嫩葉上的產(chǎn)卵量和若蟲數(shù)明顯減少，顯著低于噴水對(duì)照，其中卵存活率最高，其次為高齡若蟲，而1-2齡若蟲存活率最低。Yang等(2013)在0.5%～2%濃度HMO處理后發(fā)現(xiàn)亞洲柑橘木虱顯著減少柑橘葉片上的刺吸行為。

為進(jìn)一步明確HMO對(duì)亞洲柑橘木虱成蟲刺吸行為的影響，探索采用HMO控制其田間種群和減輕柑橘黃龍病危害的理論依據(jù)，為下一步開展柑橘黃龍病和柑橘木虱的綜合防控奠定基礎(chǔ)，我們采用EPG技術(shù)開展不同濃度HMO對(duì)亞洲柑橘木虱成蟲在柑橘上的刺吸取食行為影響的研究，并初步分析HMO控制亞洲柑橘木虱和柑橘黃龍病的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試植物和昆蟲

健康真龍柚Citrusgrandiscv. Zhenlongyou種子，來(lái)自浙江省柑橘研究所的國(guó)家柑橘品種改良中心浙江分中心，種子去皮，播于蛭石中萌發(fā)，發(fā)芽2～3月(葉3～5片)后，挑選生長(zhǎng)一致的植株用作亞洲柑橘木虱的寄主植物進(jìn)行EPG測(cè)試，實(shí)驗(yàn)所用的HMO采用韓國(guó)SK農(nóng)用噴淋油(綠穎，EnSpray 99，一種nC24礦物油，韓國(guó)SK公司生產(chǎn))，在EPG實(shí)驗(yàn)開始前一天采用手持噴霧器對(duì)供試植株葉片正反面噴施至完全噴濕為止，并在實(shí)驗(yàn)室陰干1 d，用過(guò)的植株不再作為下一次實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)所用亞洲柑橘木虱從浙江省臺(tái)州市黃巖區(qū)頭陀鎮(zhèn)一處果園(28°38′35″N, 121°09′30″E)收集后飼養(yǎng)于浙江省柑橘研究所玻璃溫室內(nèi)，采用九里香罩籠飼養(yǎng)3年，實(shí)驗(yàn)前提前1 d將日齡在15 d左右的成蟲移入EPG測(cè)試實(shí)驗(yàn)室內(nèi)罩養(yǎng)蟲籠的真龍柚植株上，用過(guò)的亞洲柑橘木虱不再作為下一次實(shí)驗(yàn)材料。EPG實(shí)驗(yàn)所用的銀膠、銅釘、金絲購(gòu)自上海應(yīng)賽儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)HMO濃度0.25%, 0.5%, 1%和2% (v/v) 處理和清水對(duì)照，每處理4組重復(fù)，每重復(fù)分別隨機(jī)記錄15次單頭亞洲柑橘木虱成蟲在單株柑橘植株有效刺吸信號(hào)，剔除12 h測(cè)試結(jié)束前由于亞洲柑橘木虱成蟲脫落而導(dǎo)致信號(hào)中斷的無(wú)效信號(hào)。

1.3 EPG實(shí)驗(yàn)

EPG實(shí)驗(yàn)在一個(gè)專用房間進(jìn)行，照明采用LED節(jié)能燈，光照強(qiáng)度300 lx、溫度控制在26～28℃、相對(duì)濕度維持在65%～70%，測(cè)試從下午14∶00開始，共記錄12 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)段光周期維持14∶00-18∶00光期，18∶00-第2天2∶00暗期，采用Giga-8型刺探電位儀 (EPG系統(tǒng)， Laboratory of Entomology, Wageningen University, The Netherlands)，通過(guò)Giga-8型DC EPG放大器記錄信號(hào)，信號(hào)放大倍數(shù)調(diào)整為100倍。

將飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)蟲籠內(nèi)的亞洲柑橘木虱成蟲取出饑餓2 h，置于冰箱中在0℃下冷凍3～5 min，迅速用導(dǎo)電性銀膠將18 μm直徑的金絲粘到亞洲柑橘木虱成蟲背板中間，粘結(jié)結(jié)束后，靜置3～5 min使其能正常活動(dòng)后，轉(zhuǎn)入法拉第籠中處理過(guò)的真龍柚植株上幼嫩并完全展開的葉片上，連接金絲到電極，植物電極則插入土壤，然后關(guān)上法拉第籠門，屏蔽外界干擾，開啟EPG儀器和記錄，一次同時(shí)進(jìn)行8組相同HMO濃度處理的亞洲柑橘木虱成蟲EPG信號(hào)記錄。采用Stylet+d.exe Version 1.2軟件接受信號(hào)，將12 h內(nèi)完成有效刺吸的記錄的EPG波形圖像貯存，采用stylet+a.exe Version 1.2軟件分析，參考Bonani等 (2010)方法，將亞洲柑橘木虱的EPG波形分為np波(非刺探波)，C波(路徑波,即口針在表皮細(xì)胞組織內(nèi)的移動(dòng)和探尋活動(dòng)和唾液分泌)，D波(為口針第一次接觸韌皮部組織)，E1波(代表在韌皮部出現(xiàn)唾液分泌)，E2波(代表在韌皮部吸食汁液)，G波(代表在木質(zhì)部吸食汁液)，分析波形后并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入EPG_analysis work sheet_v4.4.1(Sarriaetal., 2009)統(tǒng)計(jì)每組有效刺吸信號(hào)參數(shù)的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將各波形參數(shù)采用DPS14.5系統(tǒng)單因素方差分析和Tukey氏檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，設(shè)定P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 亞洲柑橘木虱成蟲在HMO處理柑橘苗上的各種波形持續(xù)時(shí)間百分比

12 h內(nèi)，對(duì)照組C波持續(xù)時(shí)間百分比為52.49%±3.52%，顯著低于各濃度HMO處理組(P<0.05)，表明HMO處理后使得亞洲柑橘木虱成蟲在柑橘葉片取食適應(yīng)性下降。各濃度HMO處理E2波持續(xù)時(shí)間百分比為7.72%±1.83%至10.96%±4.26%，均顯著低于對(duì)照組(27.73%±1.50%)(P<0.05)。對(duì)照組中跟韌皮部吸食行為有關(guān)的3個(gè)波形D+E1+E2持續(xù)時(shí)間的比例為29.35%±1.18%，顯著高于各濃度HMO處理組(P<0.05)，表明葉面噴施HMO后顯著減少了亞洲柑橘木虱在柑橘葉片韌皮部的取食(表1)。

表1 亞洲柑橘木虱成蟲在HMO處理的柑橘(Citrus grandis)葉片上12 h內(nèi)各種EPG波形持續(xù)時(shí)間百分比Table 1 Percentage of duration of various EPG waveforms of Diaphorina citri adults in response to depositsof HMO on the surfaces of citrus (Citrus grandis) leaves within 12 h

2.2 亞洲柑橘木虱成蟲在HMO處理柑橘苗上的各種EPG特征信號(hào)分析

圖1顯示，噴灑不同濃度的HMO顯著減少了亞洲柑橘木虱在柑橘葉片上的刺探次數(shù)，隨著HMO濃度增加，刺探次數(shù)減少。 各濃度HMO處理組的平均刺探次數(shù)均顯著少于清水對(duì)照組(P<0.05)，較高濃度的1%和2% HMO處理組刺探次數(shù)均顯著少于0.25%和0.5%處理組(P<0.05)，但1%和2% HMO處理組間刺探次數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

圖1 HMO處理對(duì)亞洲柑橘木虱成蟲有效刺探次數(shù)的影響Fig. 1 Effect of HMO treatment on the number ofeffective probes of Diaphorina citri adultsHMO: 園藝礦物油Horticultural mineral oil (nC24). 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示差異具顯著(P<0.05, Tukey氏檢驗(yàn))。圖2和3同。Data in the figure are mean±SE. Different small letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Tukey’s test). The same for Figs. 2 and 3.

各濃度HMO處理對(duì)各波形次數(shù)影響的結(jié)果顯示，清水對(duì)照組亞洲柑橘木虱的每成蟲C波(圖2: A)、D+E1波(圖2: B)、E2波(圖2: C)和G波(圖2: D)次數(shù)均顯著高于各濃度HMO處理組(P<0.05)。其中，C波(圖2: A)、D+E1波(圖2: B)和E2波(圖2: C)均隨著HMO濃度增加而減少。上述結(jié)果表明，噴施HMO可以顯著減少亞洲柑橘木虱在柑橘植株韌皮部和木質(zhì)部上的主動(dòng)取食行為次數(shù)。

每成蟲各波形累積時(shí)間(WDI)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果顯示(表2)，不同濃度HMO處理組亞洲柑橘木虱的C波WDI均大于清水對(duì)照組，但不同濃度HMO處理組間不存在顯著性差異(P>0.05)，清水對(duì)照組的D波、E1波、E2波和G波WDI均顯著大于各濃度HMO處理組(P<0.05)， 其中E1波WDI呈現(xiàn)出隨著HMO濃度增加而顯著減少的趨勢(shì)(P<0.05)。

圖2 HMO處理對(duì)亞洲柑橘木虱成蟲各波形次數(shù)的影響Fig. 2 Effect of HMO treatment on the number of various waveform events of Diaphorina citri adults

表2 亞洲柑橘木虱成蟲在HMO處理的柑橘(Citrus grandis)葉片上12 h內(nèi)各波形持續(xù)時(shí)間平均值Table 2 The mean duration of various waveforms of Diaphorina citri adults in response to depositsof HMO sprays on the surfaces of citrus (Citrus grandis) leaves within 12 h

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)每成蟲各種波形單次持續(xù)時(shí)間(WDE)的結(jié)果顯示，各濃度HMO處理組np波、D波和E2波WDE均低于清水對(duì)照組；2% HMO處理組D波、E1波和E2波WDE顯著低于其他濃度的HMO處理組和清水對(duì)照組(P<0.05)。各濃度HMO處理組C波WDE均顯著高于清水對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

與清水對(duì)照比較，不同濃度HMO處理顯著推遲了亞洲柑橘木虱成蟲從口器接觸葉片到第1次出現(xiàn)刺探的時(shí)間(圖3: A)和成蟲從口器接觸葉片到第1次出現(xiàn)韌皮部刺探的時(shí)間(圖3: B)。

圖3 HMO處理對(duì)亞洲柑橘木虱成蟲從口器接觸葉片到出現(xiàn)第1次刺探時(shí)間(A)和從口器接觸葉片到出現(xiàn)第1次韌皮部刺探時(shí)間(B)的影響Fig. 3 Effect of HMO treatment on the time from mouthpart contact with leaf to the first probe (A) and the time from mouthpart contact with leaf to the first phloem probe (B) of Diaphorina citri adults

3 討論

化學(xué)農(nóng)藥防治亞洲柑橘木虱是控制柑橘黃龍病的主要手段之一，通常采取增加化學(xué)農(nóng)藥噴施次數(shù)和統(tǒng)一時(shí)間噴藥方法對(duì)亞洲柑橘木虱進(jìn)行防治，從而切斷柑橘黃龍病的田間傳播，但是多次使用化學(xué)合成農(nóng)藥會(huì)造成生態(tài)環(huán)境不利影響和果實(shí)化學(xué)農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)(Raeetal., 1997; 余繼華等, 2017)。美國(guó)佛羅里達(dá)州隔2周噴施一次低劑量HMO，3年的試驗(yàn)表明能顯著降低亞洲柑橘木虱的成蟲和若蟲的蟲口數(shù)量(Stansly and Tansey, 2015)，因此，安全環(huán)保的HMO具有應(yīng)用于亞洲柑橘木虱防治的潛力。

通過(guò)亞洲柑橘木虱口針在不同植物組織內(nèi)所對(duì)應(yīng)的EPG波形特征，可以明確其取食行為和取食時(shí)長(zhǎng)，Bonani等(2010)和楊成良等(2011)已經(jīng)將亞洲柑橘木虱成蟲在甜橙幼苗產(chǎn)生的EPG波形與相關(guān)唾液鞘末端通過(guò)植物組織相關(guān)性進(jìn)行對(duì)應(yīng)，定義了亞洲柑橘木虱取食行為的各種相關(guān)波形。在EPG波形基礎(chǔ)上研究亞洲柑橘木虱寄主選擇性、亞洲柑橘木虱傳播黃龍病菌的機(jī)制、植物的抗蟲機(jī)制，以及一些藥劑對(duì)于亞洲柑橘木虱行為影響等行為生態(tài)學(xué)研究，已經(jīng)成為亞洲柑橘木虱生理學(xué)研究的熱點(diǎn)。朱紅梅等(2010)通過(guò)EPG技術(shù)分析亞洲柑橘木虱在番石榴精油處理過(guò)的柑橘苗上取食行為變化，驗(yàn)證了番石榴精油對(duì)亞洲柑橘木虱種群抑制的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)亞洲柑橘木虱在番石榴精油處理過(guò)的橘苗上相比于清水對(duì)照顯著增加了木質(zhì)部取食次數(shù)、非刺探時(shí)間、刺探定位時(shí)間、韌皮部分泌唾液時(shí)間，顯著減少了取食時(shí)間和韌皮部取食時(shí)間。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)HMO處理橘苗后亞洲柑橘木虱在12 h內(nèi)的刺探次數(shù)明顯減少(圖1)，同時(shí)顯著減少了取食時(shí)間和韌皮部取食時(shí)間(表1)。

目前HMO對(duì)昆蟲的作用機(jī)制仍不明確，但前人推測(cè)其作用主要與以下因素有關(guān)：一是破壞昆蟲身體的上表皮脂肪，二是掩蔽產(chǎn)卵的刺激劑，三是抑制寄主植物揮發(fā)性誘食劑的釋放，四是直接對(duì)害蟲驅(qū)避等(Liu and Beattie, 2002; Poerwantoetal., 2012; Mirandaetal., 2014)。柑橘幼嫩組織或許分泌出一種獨(dú)特的揮發(fā)物從而引誘亞洲柑橘木虱成蟲取食，Ouyang等(2013)推測(cè)HMO可能是進(jìn)入植物氣孔阻止植物揮發(fā)性物質(zhì)的釋放，因抑制或掩蓋柑橘葉片表面的揮發(fā)性物質(zhì)而減少了亞洲柑橘木虱在寄主上定殖。我們根據(jù)亞洲柑橘木虱在噴施不同濃度HMO和噴施清水的柑橘葉片上的取食行為變化，發(fā)現(xiàn)跟韌皮部取食行為有關(guān)的3個(gè)波形D+E1+E2持續(xù)時(shí)間的百分比清水對(duì)照顯著高于HMO處理(表1)，說(shuō)明使用HMO顯著減少亞洲柑橘木虱在柑橘葉片韌皮部取食時(shí)間和取食次數(shù)；也發(fā)現(xiàn)HMO處理明顯推遲第1次刺探時(shí)間和第1次韌皮部刺探開始時(shí)間(圖3)，與Yang等(2013)報(bào)道的亞洲柑橘木虱成蟲的取食活動(dòng)明顯受HMO在葉面的殘留影響，取食活動(dòng)隨HMO的濃度升高而明顯降低等結(jié)果類似。Yang等(2013)同時(shí)發(fā)現(xiàn)HMO使用濃度與刺探次數(shù)呈指數(shù)負(fù)相關(guān)，隨著HMO使用濃度提高，刺探次數(shù)呈指數(shù)減少，HMO在高于0.5%濃度以上影響幅度較小。我們也發(fā)現(xiàn)1%與2% HMO對(duì)亞洲柑橘木虱的刺探次數(shù)的影響沒有顯著差異(圖1)，初步推測(cè)HMO的作用機(jī)制可能是其進(jìn)入植物氣孔阻止植物揮發(fā)性物質(zhì)的釋放，從而抑制或掩蓋柑橘葉片表面的揮發(fā)性物質(zhì)，減少了亞洲柑橘木虱在寄主上取食誘導(dǎo)，因此可能在一定的HMO使用濃度閾值下，就能減少柑橘葉片上的植物揮發(fā)性物質(zhì)的釋放。

Wu等(2016)提出帶黃龍病菌的亞洲柑橘木虱在韌皮部出現(xiàn)唾液分泌過(guò)程中容易傳播柑橘黃龍病。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，亞洲柑橘木虱12 h內(nèi)在HMO處理過(guò)的橘苗上取食，E1波累積時(shí)間隨HMO濃度增加而顯著縮短，而且顯著低于清水對(duì)照，2% HMO處理E1波累積時(shí)間比清水對(duì)照減少約17倍(表2)，因此高濃度的HMO可以顯著降低柑橘黃龍病的傳播幾率。E2波為吸食汁液過(guò)程，E2波累積時(shí)間的長(zhǎng)短是判斷植物適合度的重要指標(biāo), 直接反映亞洲柑橘木虱在寄主取食生存。Luo等(2016)進(jìn)行了亞洲柑橘木虱在帶柑橘黃龍病菌橘苗上的獲菌試驗(yàn)，24頭有E2波形的柑橘木虱中23頭獲得了柑橘黃龍病菌，說(shuō)明韌皮部吸食到汁液過(guò)程直接影響黃龍病菌的獲取。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各濃度HMO處理E2波持續(xù)時(shí)間百分比顯著低于清水對(duì)照(表1)，E2波累積時(shí)間、E2波單次持續(xù)時(shí)間、E2波次數(shù)均顯著低于清水對(duì)照(圖2; 表2)，表明HMO顯著影響亞洲柑橘木虱在柑橘上的取食行為，改變了亞洲柑橘木虱寄主的適應(yīng)度，降低了柑橘木虱在黃龍病樹上的獲菌幾率。這可能是我們?cè)趪?guó)內(nèi)一些多年連續(xù)使用HMO的橘園發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病發(fā)生率和亞洲柑橘木虱蟲口密度相對(duì)較低的原因。

本研究通過(guò)EPG技術(shù)進(jìn)一步揭示了HMO對(duì)亞洲柑橘木虱的控制作用，表明柑橘噴施HMO后亞洲柑橘木虱顯著減少取食次數(shù)和有效取食時(shí)間，降低了亞洲柑橘木虱寄主適應(yīng)性，同時(shí)還顯著減少了其在韌皮部的分泌唾液時(shí)間，從而降低黃龍病傳播的幾率，因此在柑橘黃龍病和亞洲柑橘木虱的綜合防治體系中，HMO是一種值得推薦的產(chǎn)品。根據(jù)HMO濃度與取食行為不存在線性相關(guān)結(jié)果，初步推斷HMO的作用機(jī)制可能是其進(jìn)入植物氣孔阻止植物揮發(fā)性物質(zhì)的釋放，從而抑制或掩蓋柑橘葉片表面的揮發(fā)性物質(zhì)，減少了亞洲柑橘木虱在寄主上取食，因此可能在一定作用閾值下，就能減少亞洲柑橘木虱在柑橘葉片上的取食，后續(xù)尚需通過(guò)組織學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定，同時(shí)進(jìn)一步開展田間試驗(yàn)確定最佳的HMO施用濃度和使用次數(shù)。