黃柳，張瑞寧，田小超，郭炳彥，劉素云，李擁軍

研究發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞水平升高是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑莫?dú)立危險因子，越來越多的證據(jù)表明了單核細(xì)胞在急性心肌梗死后炎癥反應(yīng)過程中的關(guān)鍵作用[1,2]。外周血單核細(xì)胞及其亞群分布與心血管疾病的關(guān)系日漸受到關(guān)注。單核細(xì)胞亞群分型的國際共識將其分為典型（CD14++CD16-）、中間型（CD14++CD16+）和非典型（CD14+CD16++）單核細(xì)胞三個亞群[3]。蔡洪濱等[4]研究顯示CD14++CD16+單核細(xì)胞可以增加透析患者發(fā)生心臟事件的風(fēng)險，并與急性心肌梗死后心室功能惡化有關(guān)。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）是具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能的一種多能干細(xì)胞，兼有內(nèi)分泌、內(nèi)皮修復(fù)、血管再生等多種生物功能[5]。EPCs與心血管疾病的關(guān)系日益受到人們重視。研究發(fā)現(xiàn)，心血管病的危險因素如高血壓、高脂血癥、吸煙、糖尿病、冠狀動脈疾病家族史等均存在EPCs數(shù)量減少和功能障礙[6]。本研究旨在分析比較冠心病患者及健康志愿者外周血中CD14++CD16+單核細(xì)胞水平，并通過體外實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)，研究其對EPCs體外功能及其體內(nèi)修復(fù)缺血心肌能力的影響。旨在為臨床診治冠心病提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2018年10月至2019年3月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)科治療的冠心病患者20例和同期接受檢查的健康志愿者20例；其中冠心病組中男性10例，女性10例；年齡48～77歲，平均年齡（51.21±8.65）歲；病程7～10年，平均（8.49±1.19）年。健康組中男性10例，女性10例；年齡50～75歲，平均年齡（60.01±7.11）歲，兩組患者在性別、年齡等一般資料比較，差異無計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。冠心病組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均確診為冠心?。虎跓o精神疾?。虎蹮o意識障礙；排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有嚴(yán)重的肝腎功能不全；②嚴(yán)重貧血；③嚴(yán)重感染疾病。本研究通過我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均知情且簽署知情同意書。

健康雄性SD大鼠40只，體重200～220 g，購于中國食品藥品檢定研究院[許可證號：SCXK(京)2014-0013]，所有SD大鼠均飼養(yǎng)在中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2014-0033]，培育室溫度20～25 ℃，濕度保持在65%～70%，進(jìn)行人工光照，全天自由飲水，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中均嚴(yán)格遵循“3R”原則，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 主要儀器與試劑RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購自Santa Cruze Biotechnology公司；GL-16M低溫離心機(jī)購自濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司熒光分光光度計(jì)購自上海儀電分析儀器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；APC標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體CD14、FITC標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體CD16、陰性對照IgG 購自購自美國BD公司；M199培養(yǎng)液購自Gibco公司；BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 CD14++CD16+水平檢測采集研究對象肘靜脈血5 ml，取15 ml全血置于枸櫞酸鈉抗凝管中，加入對照抗體60 μl，避光孵育15 min，加入1 ml的紅細(xì)胞裂解液，混勻避光孵育10 min，每個流式管中加入Flow-countTM熒光微球并充分混勻。使用四色流式分析兩組患者CD14++CD16+含量百分比。檢測流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置參考楊國紅等[7]研究方法。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)將健康志愿者的EPCs培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)基中，保存在溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；使用流式細(xì)胞儀分離冠心病患者全血內(nèi)的CD14++CD16+細(xì)胞，加入健康志愿者的EPCs中并培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基中，保存在溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測EPCs的遷移能力取健康志愿者對數(shù)期的EPCs和將病患者全血內(nèi)的CD14++CD16+細(xì)胞加入健康志愿者的EPCs的對數(shù)期細(xì)胞，分別在健康志愿者對數(shù)期的EPCs和健康志愿者對數(shù)期的EPCs加入冠心病患CD14++CD16+細(xì)胞上用槍頭劃橫線的，培養(yǎng)1 d后顯微鏡下再次觀察拍照。

1.3.4 蛋白質(zhì)檢測取對數(shù)期細(xì)胞，吸除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基保存于滅菌離心管中。使用1200 r/min離心10 min后加入裂解液重懸細(xì)胞，放置于冰中裂解30 min，再次以1200 r/min離心10 min，加入200 μl的Loading Buffer 緩沖液，100℃煮沸10 min；使用BCA法測定蛋白濃度后，使用SDS-PAGE電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后放入 TBST 溶液中緩慢搖動洗膜5 min，再將 PVDF 膜放入配制好的一抗液中孵育，室溫下緩慢搖動 30 min后放入4℃恒溫箱中過夜。取出后使用TBST洗滌3遍后放入二抗反應(yīng)液中室溫孵育2 h；封閉液：二抗為2000:1；曝光后以Actin為內(nèi)參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為相對蛋白表達(dá)水平。

1.3.5 建立大鼠模型及移植將30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，建立冠心病大鼠模型。具體方法：喂飼高脂飼料，含量為：2%膽固醇，10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、87.3%基礎(chǔ)飼料，喂養(yǎng)2周，飲水自由，制成冠心病大鼠模型。完成造模后，將大鼠隨機(jī)分為兩組，每組各15只，分別將內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞和CD14++CD16+單核細(xì)胞共培養(yǎng)后顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為（1～2）×108個/ml，染色觀察活細(xì)胞數(shù)目＞90%，在無菌環(huán)境下取0.1 ml的細(xì)胞懸濁液注入裸鼠大腿根部皮下。

1.3.6 大鼠心肌新生血管密度和壞死心肌面積檢測移植后4周，腹腔注射10%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，打開大鼠胸腔，充分暴露心臟，剪開右心耳用使用多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，測定各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)（MVC）、微血管密度（MVD）。取大鼠心肌，HE染色正常組織呈紅色，缺血組織呈白色。溫孵并拍照，用Image-ProPlus軟件對梗死區(qū)面積及梗死區(qū)、正常區(qū)面積進(jìn)行分析計(jì)算，心肌梗死率。心肌梗死率（%）=（梗死區(qū)總面積/全心肌總面積）×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CD14++CD16+水平比較相比健康組，冠心病組患者全血內(nèi)CD14++CD16+細(xì)胞個數(shù)及CD14++CD16+細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.05，表1）。

2.2 兩組細(xì)胞遷移能力檢測結(jié)果相比劃痕0 h時拍照兩組細(xì)胞數(shù)目密度基本無差異；24 h后將冠心病患者全血內(nèi)的CD14++CD16+細(xì)胞加入健康志愿者的EPCs細(xì)胞劃痕愈合率顯著低于健康組（P＜0.05，圖1和表2）。

表1 兩組CD14++CD16+水平比較（）

表1 兩組CD14++CD16+水平比較（）

注：與健康組相比，aP＜0.05

2.3 兩組細(xì)胞黏附能力檢測相比健康組冠心病組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，圖2和表3）。

圖1 兩組細(xì)胞遷移及粘附能力檢測結(jié)果

表2 兩組細(xì)胞遷移及粘附能力檢測結(jié)果（）

表2 兩組細(xì)胞遷移及粘附能力檢測結(jié)果（）

注：與健康組相比，aP＜0.05

圖2 兩組細(xì)胞黏附能力檢測

表3 兩組細(xì)胞黏附能力相關(guān)蛋白相對表達(dá)（）

表3 兩組細(xì)胞黏附能力相關(guān)蛋白相對表達(dá)（）

注：與健康組相比，aP＜0.05

2.4 各組大鼠新生血管數(shù)、微血管密度及心肌梗死面積百分比檢測結(jié)果性別對照組大鼠，模型組大鼠新生血管數(shù)、微血管密度及心肌梗死面積百分比顯著升高（P＜0.05，表4）。

3 討論

表4 各組大鼠新生血管數(shù)值、微血管密度及心肌梗死面積百分比檢測結(jié)果（）

表4 各組大鼠新生血管數(shù)值、微血管密度及心肌梗死面積百分比檢測結(jié)果（）

注：與健康組相比，aP＜0.05

內(nèi)皮祖細(xì)胞功能不全是冠心病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)之一[8]。劉征等[9]研究表明：內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量減少、增殖和遷移功能受損與冠心病關(guān)系密切。冠心病患者體內(nèi)的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能同時其增殖和遷移功能受損的影響因素尚不非常清楚。同時有研究表明，冠心病患者外周血CD14++CD16+單核細(xì)胞水平顯著高于健康者[10]，但目前還沒有研究表明外周血CD14++CD16+單核細(xì)胞水平與內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能及遷移能力有直接聯(lián)系，本研究探索了CD14++CD16+單核細(xì)胞水平分析及其對內(nèi)皮祖細(xì)胞體外功能的影響。

CD14++CD16+是單核細(xì)胞作為循環(huán)中單核細(xì)胞亞群中的一個重要亞群[11]。本研究發(fā)現(xiàn)冠心病組患者全血內(nèi)CD14++CD16+細(xì)胞個數(shù)及CD14++CD16+細(xì)胞百分比顯著升高。這可能是因?yàn)楣谛牟』颊唧w內(nèi)有炎癥反應(yīng)，CD14++CD16+單核細(xì)胞具有的促炎癥活性，在冠心病患者外周血內(nèi)顯著升高。楊國紅等[12]研究表明，冠心病患者外周血內(nèi)CD14++CD16+含量水平顯著升高，與本研究得出的結(jié)論相一致。

內(nèi)皮祖細(xì)胞是具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能的一種多能干細(xì)胞，兼有內(nèi)分泌、內(nèi)皮修復(fù)、血管再生等多種生物功能[13]。心血管病的危險因素如高血壓、高脂血癥、吸煙、糖尿病、冠狀動脈疾病家族史等均存在EPCs數(shù)量減少和功能障礙[14]。本研究發(fā)現(xiàn)將冠心病患者全血內(nèi)的CD14++CD16+細(xì)胞加入健康志愿者的EPCs細(xì)胞遷移能力明顯減弱。說明加入了患者全血內(nèi)的CD14++CD16+細(xì)胞一起培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能受到了顯著的抑制，同時其遷移能力也顯著減弱。可能顯著影響了內(nèi)皮修復(fù)、血管再生受損和微脈管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。EMT是指上皮細(xì)胞能暫時喪失細(xì)胞極性獲得間質(zhì)細(xì)胞移動能力。腫瘤細(xì)胞能夠通過細(xì)胞極性喪失，改變自身細(xì)胞形態(tài)與其他細(xì)胞分離[15,16]；同時通過下調(diào)細(xì)胞粘附因子E-鈣粘蛋白（E-Cadherin）的表達(dá)[17]，N-鈣粘蛋白（N-Cadherin）表達(dá)，將角蛋白細(xì)胞骨架變?yōu)椴ㄐ渭?xì)胞骨架，促進(jìn)細(xì)胞穿透胞間連接，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比健康組冠心病組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低。說明說明加入了病患者全血內(nèi)的CD14++CD16+細(xì)胞一起培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附相關(guān)蛋白表達(dá)受到促進(jìn)，其黏附能力升高。李春雨等[19]研究表明：調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)黏附蛋白的表達(dá)水平，可以改變EMT過程，有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附能力，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，冠心病患者外周血中CD14++CD16+含量水平顯著高于健康志愿者，且CD14++CD16+可以降低內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力，這可能是因?yàn)镃D14++CD16+抑制了內(nèi)皮足細(xì)胞的功能，但本研究尚沒有深入的研究相關(guān)機(jī)制，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步研究其抑制的機(jī)制，以及涉及到的相關(guān)蛋白和信號通路。