李源繁，楊國(guó)杰，李棟博，李國(guó)棟，秦鵬，魏子寒

心絞痛是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑淖畛Ｒ姳憩F(xiàn)形式之一，多由暫時(shí)性心肌缺血引起，以胸痛為主要特征[1]。冠狀動(dòng)脈（冠脈）側(cè)支循環(huán)形成是慢性或反復(fù)性心肌缺血繼發(fā)的一種代償機(jī)制，良好的側(cè)支循環(huán)形成有利于減輕狹窄或閉塞的冠脈缺血、缺氧，限制和縮小心肌梗死面積，改善心室功能，提高患者生存率[2,3]。冠心病患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成個(gè)體差異較大，可能與基礎(chǔ)疾病、缺血時(shí)間及冠脈病變嚴(yán)重程度等有關(guān)，其具體機(jī)制尚不明確。微小RNA（miRNA）是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，多種miRNA與冠心病及相關(guān)性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中miR-144與冠心病嚴(yán)重程度、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成等有關(guān)[4-7]，但與穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成的關(guān)系鮮有研究。血管生成素（Ang）是一種分泌性生長(zhǎng)因子，與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其中Ang1可促進(jìn)血管網(wǎng)的成熟，Ang2主要刺激新生血管形成[8]。因此本研究擬分析穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平與冠脈側(cè)支循環(huán)形成的關(guān)系，以探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2018年10月～2019年12月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的行冠脈造影檢查確診的穩(wěn)定性心絞痛患者134例，根據(jù)Rentrop分級(jí)分為側(cè)支循環(huán)形成良好組（Rentrop分級(jí)≥2，n=76）及不良組（Rentrop分級(jí)≤1，n=58）。收集所有受試者基線資料，包括年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、血壓、血脂、治療史及血清標(biāo)本等。本研究經(jīng)本院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有受試患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)指定的《慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南》[9]中穩(wěn)定性心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床資料完整者；既往未接受過冠脈旁路移植術(shù)或經(jīng)皮冠脈介入治療（PCI）者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重肝、腎等臟器功能不全者；合并嚴(yán)重感染性疾病、血液系統(tǒng)傳染性疾病及惡性腫瘤者；合并先天性心臟病及瓣膜性心臟病者；近3月內(nèi)有急性心肌梗死病史者。

1.3 方法

1.3.1 Rentrop分級(jí)由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的心血管醫(yī)師采用雙盲法根據(jù)冠脈造影結(jié)果，采用Rentrop分級(jí)方法對(duì)側(cè)支循環(huán)形成進(jìn)行分級(jí)：無側(cè)支循環(huán)形成為0級(jí)；病變遠(yuǎn)端分支顯影為1級(jí)；病變遠(yuǎn)端血管部分顯影為2級(jí)；病變遠(yuǎn)端血管完全顯影為3級(jí)。其中0～1級(jí)為側(cè)支循環(huán)形成不良；2～3級(jí)為側(cè)支循環(huán)形成良好。

1.3.2 Gensini評(píng)分冠脈狹窄嚴(yán)重程度采用Gensini評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)。Gensini評(píng)分系統(tǒng)按照美國(guó)心臟協(xié)會(huì)規(guī)定的冠脈血管圖像分段評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]：正常，0分；≤25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，4分；76%～90%，8分；91%～99%，16分；100%，32分。狹窄部位不同，賦予系數(shù)不同：左主干×5；左前降支近段×2.5，中段×1.5，遠(yuǎn)段×1.0；第一對(duì)角支×1.0，第二對(duì)角支×0.5；回旋支近段×2.5，中段×1.5，遠(yuǎn)段×1.0；后降支×1.0；后側(cè)支×0.5；右冠近、中、遠(yuǎn)后降支×1.0。同時(shí)根據(jù)病變支數(shù)分為單支組（前降支、回旋支或右冠任意1支發(fā)生病變，血管狹窄≥50%）；2支組（前降支、回旋支或右冠任意2支有病變，至少1支血管狹窄≥70%，左主干病變屬2支組）；3支組（前降支、回旋支和右冠均發(fā)生病變，至少1支血管狹窄≥90%）。Gensini評(píng)分=（單處病變狹窄程度積分×相應(yīng)系數(shù)）×總支數(shù)。

1.3.3 血清miR-144水平檢測(cè)采用Trizol試劑（Takara公司）提取血清總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎脤?shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RTqPCR）擴(kuò)增miR-144。引物由上海生工合成。miR-144上游引物序列（5′→3′）為：ATCCAGTGCGTGTCGTG，下游引物序列（5′→3′）為：TGCTTATACAGTATAGATG；內(nèi)參U6上游引物序列（5′→3′）為：GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT，下游引物序列（5′→3′）為：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。20 μl反應(yīng)體系：SYBR? Green Mix 10 μl，cDNA（50 ng/μl）1 μl，上下游引物（10 μM）各0.5 μl，ddH2O 8.0 μl。反應(yīng)條件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法分析血清中miR-144相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 血清Ang1/2水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELLSA）檢測(cè)血清Ang1/2水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒均由上海澤葉生物科技有限公司提供，貨號(hào)分別為abx520454、abx511338。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，兩兩比較采用Mann-Whiteney秩和檢驗(yàn)。采用Spearman法分析穩(wěn)定心絞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平與Gensini評(píng)分的相關(guān)性；繪制受試者工作特性曲線（ROC）分析血清miR-144、Ang1/2水平對(duì)穩(wěn)定性心絞痛患者側(cè)支循環(huán)形成不良的預(yù)測(cè)價(jià)值。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較側(cè)支循環(huán)形成不良組與良好組穩(wěn)定性心絞痛患者年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、血脂異常、高血壓、藥物治療史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表1。

2.2 兩組患者Gensini評(píng)分及血清miR-144、Ang1/2水平比較與側(cè)支循環(huán)形成良好組比較，不良組穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1、Ang2水平降低，Gensini評(píng)分增加（P＜0.05），表2。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 側(cè)支循環(huán)不良組與良好組患者血清miR-144、Ang1/2水平比較

2.3 穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144水平與Ang1、Ang2呈正相關(guān)（r=0.402、0.404，P＜0.05），圖1。

2.4 穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平與Gensini評(píng)分的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1、Ang2水平與Gensini評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.707、-0.401、-0.454，P＜0.05），圖2。

圖1 穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144與Ang1/2水平的相關(guān)性

圖2 穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144（A）、Ang1（B）、Ang2（C）水平與Gensini評(píng)分的相關(guān)性

2.5 血清miR-144、Ang1/2水平對(duì)穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成不良的預(yù)測(cè)價(jià)值血清miR-144、Ang1、Ang2水平預(yù)測(cè)穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成不良的曲線下面積（AUC）分別為0.907（95%CI：0.851～0.962）、0.698（95%CI：0.608～0.788）、0.728（95%CI：0.454～0.812），截?cái)嘀捣謩e為0.644、3.082 ng/ml、10.753 ng/ml，靈敏度分別為86.20%、98.30%、94.80%，特異度分別為89.50%、56.50%、46.10%。三者聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.915（95%CI：0.858～0.967），靈敏度及特異度分別為93.10%、90.80%，圖3。

圖3 血清miR-144、Ang1/2預(yù)測(cè)穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成不良的ROC曲線

3 討論

良好的冠脈側(cè)支循環(huán)形成是缺血心臟病的重要保護(hù)機(jī)制，目前評(píng)價(jià)側(cè)支循環(huán)形成的方法主要為冠脈造影，但因其為有創(chuàng)性，存在一定局限，因此尋找簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的血清學(xué)生物指標(biāo)預(yù)測(cè)穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成對(duì)患者臨床診療及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-144與冠心病、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能密切相關(guān)。miR-144消融可增加波形蛋白的表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[5]，miR-144信號(hào)通路缺失可阻斷心肌梗死后細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，導(dǎo)致心功能惡化[11]。Gao等[12]研究報(bào)道，慢性硬膜下血腫的血腫來源外泌體通過miR-144-5p促進(jìn)異常血管生成并抑制血腫吸收，推測(cè)miR-144可能與冠脈新生血管形成有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與側(cè)支循環(huán)形成良好組比較，不良組患者血清miR-144水平顯著降低，提示miR-144水平降低可能與穩(wěn)定性心絞痛發(fā)生及其冠脈側(cè)支循環(huán)形成不良有關(guān)。

Ang在血管及動(dòng)脈生成中起重要作用，Ang1和Ang2參與血管的成熟和形成，Ang1通過保持血管完整性來防止血管重構(gòu)，在血管生成過程中可促進(jìn)其出芽及分支[13,14]。Demir等[15]研究報(bào)道，與側(cè)支循環(huán)形成良好患者比較，側(cè)支循環(huán)形成不良的穩(wěn)定性冠心病和心力衰竭患者Ang2水平較低，而Ang1水平較高。趙松峰等研究報(bào)道，人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及Ang2表達(dá)下調(diào)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與側(cè)支循環(huán)形成良好組比較，側(cè)支循環(huán)形成不良組穩(wěn)定性心絞痛患者血清Ang1、Ang2水平均顯著降低，與Demir等[15]文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致，推測(cè)可能與疾病發(fā)展時(shí)期不同及選擇患者異質(zhì)性有關(guān)，提示Ang1/2水平降低可能與穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成不良有關(guān)。基于miR-144、Ang1、Ang2均與血管生成有關(guān)，本研究采用Spearman分析其相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144水平與Ang1、Ang2水平均呈正相關(guān)，提示miR-144、Ang1、Ang2可能協(xié)同促進(jìn)穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成。另外血清miR-144、Ang1、Ang2水平與Gensini評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，提示血清miR-144、Ang1、Ang2水平可能與穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈狹窄程度有關(guān)，監(jiān)測(cè)三者水平可能對(duì)患者預(yù)后評(píng)估有一定指導(dǎo)價(jià)值。

本研究進(jìn)一步進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-144、Ang1、Ang2水平預(yù)測(cè)穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成不良的AUC分別為0.907、0.698、0.728，截?cái)嘀捣謩e為0.644、3.082 ng/ml、10.753 ng/ml，靈敏度分別為86.20%、98.30%、94.80%，特異度分別為89.50%、56.50%、46.10%。三者聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.915，靈敏度及特異度分別為93.10%、90.80%，提示聯(lián)合血清miR-144、Ang1、Ang2可顯著提高預(yù)測(cè)穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成不良的特異度，更具臨床價(jià)值。

綜上所述，血清miR-144、Ang1/2水平與穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈狹窄嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，三者聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高預(yù)測(cè)側(cè)支循環(huán)形成不良特異度，有潛力成為預(yù)測(cè)冠脈側(cè)支循環(huán)形成的生物標(biāo)志分子。但本研究樣本量少，選擇范圍局限，存在不足；關(guān)于miR-144與Ang 1/2在穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側(cè)支循環(huán)形成的具體作用機(jī)制，有待進(jìn)一步深入探究。