吳敬燚 張如涯 陳金灶

（1.福建省大田職業(yè)中專學(xué)校，福建 三明 366100；2.福建省三明市競(jìng)源生物技術(shù)有限公司，福建 三明 366100）

蔓莖堇菜為堇菜科堇菜屬植物，其化學(xué)成分主要有黃酮、萜類、糖類以及黏液質(zhì)類等。其中，做為蔓莖堇菜的主要有效化學(xué)成分的黃酮，具有極大的藥用價(jià)值，以全草入藥，性涼微苦，具有清熱解毒、散淤消腫、去腐生肌、清肺止咳之效。民間使用歷史悠久，主治瘡瘍腫毒，眼結(jié)膜炎，肺熱咳嗽，百日咳，黃疸型肝炎，水火燙傷，跌打損傷，毒蛇咬傷等?，F(xiàn)代藥理研究表明該植物具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)免疫功能、抗心肌缺血等藥理活性。研究表明，蔓莖堇菜黃酮含量豐富，是工業(yè)化生產(chǎn)黃酮的良好材料。要實(shí)現(xiàn)蔓莖堇菜次生代謝物黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)，必需確定其總黃酮的最佳提取方法。分別用熱水、乙醇和甲醇為溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取，用紫外分光光度法于波長(zhǎng)265nm處測(cè)定OD值，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算并比較各提取液總黃酮含量，從而確定蔓莖堇菜總黃酮的最佳提取工藝。

1 材料

蘆?。–27H30O16·3H2O），蔓莖堇菜樣品為三明市大田縣境內(nèi)，儀器為紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

2 總黃酮的提取方法

1）熱水浸提法:稱取樣品干燥粉末(60目)10g，加入100ml(10倍量)蒸餾水，水浴回流1h，過(guò)濾后，濾渣重復(fù)浸提2次。合并濾液，減壓濃縮至適量，放冷后，加醋酸乙酯振搖萃取(去除一些水溶性大的雜質(zhì)如糖類)并定容至100ml，得總黃酮提取液。水浴溫度分別取:70、85、100℃。

2）甲醇浸提法:稱取樣品干燥粉末(60目)10g，加入100ml(10倍量)甲醇，60℃水浴回流1h，過(guò)濾后，濾渣重復(fù)浸提2次。合并濾液，減壓濃縮至適量，置冰箱中過(guò)夜。將濃縮液過(guò)濾并定容至100ml，得總黃酮提取液。甲醇溶液濃度分別取:70%，85%，100%。

3）乙醇浸提法:稱取樣品干燥粉末(60目)10g，加入100ml(10倍量)乙醇，80℃水浴回流1h，過(guò)濾后，濾渣重復(fù)浸提2次。合并濾液，減壓濃縮至適量，置冰箱中過(guò)夜(使葉綠素沉淀)。將濃縮液過(guò)濾并定容至100ml，得總黃酮提取液。乙醇溶液濃度分別取:70%、85%、100%。

3 總黃酮含量的測(cè)定

分別吸取0.25ml上述各定容提取液于10ml容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，于265nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，試劑為空白參比，計(jì)算各提取液中總黃酮含量，即得率。計(jì)算公式如下:得率(以蘆丁計(jì))(%)=CV1V2(WV3)，式中C為樣液中含黃酮量(mg)，V1為抽提定容體積(ml)，V2為由總黃酮提取液制備樣液時(shí)所稀釋倍數(shù)，W為稱樣量(mg)，V3為樣液的定容體積(ml)。

4 結(jié)果分析

1）總黃酮的紫外吸收曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品總黃酮提取液均在波長(zhǎng)(265±10)nm處有最大吸收，且二者紫外吸收?qǐng)D譜基本一致，故以此為測(cè)定波長(zhǎng)。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。以O(shè)D值對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品含量(gL)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.00653+31.54x（如圖1），其線性范圍為0～0.1g，相關(guān)系數(shù)R=0.9998，經(jīng)檢驗(yàn)，差異極顯著(t=240.616，P＜0.01)。

3）總黃酮含量的測(cè)定。樣品測(cè)定結(jié)果可以看出，在熱水浸提法中，總黃酮得率隨著提取溫度的升高而增加，但得率都極低，最高僅為0.104%.表2數(shù)據(jù)表明，甲醇浸提法所采用的3種濃度中，以85%的甲醇效果最好，平均達(dá)2.535%.乙醇浸提法所采用的三種濃度中，以用70%乙醇為溶劑時(shí)總黃酮得率最高，平均達(dá)2.773%.由于70%乙醇是所采用3種濃度中最低的，故再以40%及55%乙醇為溶劑進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，5種濃度中以70%為最佳。比較數(shù)據(jù)表明，采用熱水浸提法所得總黃酮得率與采用另兩種方法相差兩個(gè)數(shù)量級(jí)，顯然不適用于蔓莖堇菜總黃酮的提取。采用有機(jī)溶劑乙醇或甲醇來(lái)浸提，總黃酮的得率都較高，但70%的乙醇顯然優(yōu)于85%甲醇，二者相比差異極顯著(t=11.591，P＜0.01)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

5 討論

1）以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，提取溫度、溶劑的種類和濃度均對(duì)總黃酮得率有顯著影響。

2）采用熱水浸提法，蔓莖堇菜總黃酮有一定的得率，但明顯小于采用其它兩種有機(jī)溶劑。游離黃酮、異黃酮一般難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑及稀堿液中，但其糖甙由于增加了極性基團(tuán)(-OH)，因而增加了其在水中的溶解度，減少了在有機(jī)溶劑中的溶解度?？梢酝茢啵o堇菜所含的黃酮只有少數(shù)以糖甙的形式存在，而大多以甙元的形式存在。

3）溶劑濃度是影響生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素。在上述幾種梯度濃度中，甲醇和乙醇的濃度分別以85%和70%的效果最好，且總黃酮得率在最佳濃度的兩側(cè)呈遞減趨勢(shì)。采用較低濃度的溶劑來(lái)提取時(shí)，總黃酮得率反而可能比采用高濃度溶劑要高。采用55%和85%的乙醇時(shí)，二者總黃酮得率分別為2.368%和2.269%(t=3.531，P＜0.05)，但降低溶劑濃度就增加了溶劑中的水含量，同時(shí)導(dǎo)致蔓莖堇菜成分中糖類及粘液質(zhì)的溶解度增加，從而使?jié)饪s時(shí)間變長(zhǎng)、過(guò)濾困難，使實(shí)驗(yàn)耗時(shí)明顯增加。采用70%的乙醇為溶劑時(shí)上述影響不明顯。

綜上所述，由于采樣的區(qū)域性和季節(jié)性因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性會(huì)造成影響，進(jìn)一步通過(guò)把握樣品采集和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)試劑及步驟，不斷提高提取率，還有待今后繼續(xù)研究。可以確定的是，工業(yè)化大量生產(chǎn)蔓莖堇菜黃酮類藥用成分，可以側(cè)重選用70%濃度的乙醇為提取溶劑的實(shí)驗(yàn)策略，從而切實(shí)提高提取的效率和效益。