朱俊珺

（安徽省蔬菜質(zhì)量檢測(cè)中心 安徽，馬鞍山 238200)

1 引言

無花果富有藥用醫(yī)療價(jià)值，尤其多糖作為一類重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，在抗腫瘤、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等方面具有良好的應(yīng)用前景[1]。無花果多糖作為一種免疫功能調(diào)節(jié)劑引起廣泛的重視。

由于多糖的多樣性，關(guān)于多糖的定量測(cè)定到目前為止，并沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]。利用苯酚-硫酸試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，并在490nm處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。此法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，顏色持久。但對(duì)于雜多糖，分析結(jié)果可能誤差較大。因此，本文根據(jù)無花果多糖中單糖的組成，結(jié)合主要組分單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算校正系數(shù)，來改進(jìn)傳統(tǒng)的苯酚-硫酸顯色測(cè)定。

2 無花果多糖測(cè)定實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 原料 無花果粉（粉碎過20目篩），烘干備用。

2.1.2 主要試劑 石油醚（60℃-90℃）、95%乙醇、苯酚；來自上海化學(xué)試劑。

濃硫酸、葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖；來自國藥集團(tuán)。

L-樹膠醛糖、L-鼠李糖；來自沃凱試劑。

2.1.3 主要儀器和設(shè)備（見表1）

2.2 無花果多糖的提取

2.2.1 無花果粗多糖的提取 壓過果汁的無花果果渣在鼓風(fēng)干燥箱中低溫烘干后，機(jī)械粉碎，過20目篩，用天平準(zhǔn)確稱取一定量的粉末，在69℃下采用石油醚（1：5）溶劑回流法提取2小時(shí)，重復(fù)1次。殘?jiān)鼡]干石油醚，稱重，按1：10 的比例加入蒸餾水，在100℃下采用蒸餾水（1：10）回流法提取3h，重復(fù)2 次。提取液合并濃縮后，多次加入95%乙醇生成沉淀，離心過濾直至無沉淀產(chǎn)生。收集沉淀，在40℃條件下烘干即得無花果粗多糖[3]。

2.2.2 無花果精多糖的提取 無花果粗多糖配制成水溶液后，超濾（收集分子量＞10kDa 部分），然后在60℃和0.095MPa 條件下以50r/min 進(jìn)行真空濃縮，收集20mL 左右。再經(jīng)攪拌緩慢加入無水乙醇，加入量大約四倍體積，4℃下靜置12h，離心10min 左右。得到的沉淀物用20mL無水乙醇、丙酮以及乙醚依次洗滌2次，最后真空干燥至恒重，即得無花果精制多糖[4]。稱重，計(jì)算得率，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 無花果多糖中單糖組成的GC分析

2.3.1 樣品制備 準(zhǔn)確稱取10.7mg 無花果精制多糖，加入3.0mL,2mol/L 的三氟乙酸，100℃水解8h，水解液于50℃蒸干。加入10.0mg鹽酸羥胺、0.5mL吡啶，于90℃反應(yīng)30min，并不時(shí)震蕩。冷卻至室溫，加入0.5mL醋酸酐，90℃下乙?；磻?yīng)30min，最后進(jìn)行氣相色譜分析[5]。

分別準(zhǔn)確稱取一定量的半乳糖、鼠李糖、甘露糖、樹膠醛糖、木糖和葡萄糖，加入鹽酸羥胺，內(nèi)標(biāo)0.0099g，加入吡啶3mL、乙酸酐3mL，以同樣方法進(jìn)行處理[5]。

2.3.2 GC 分析 氣相色譜HP5890，色譜柱HP-INNO-WAX 19091N-133；爐溫210℃，進(jìn)樣口250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度250℃；載氣為氮?dú)猓惠d氣流速0.82mml/min，總流量34mLmin，分流比40：1[6]。結(jié)果見圖1和圖2。

表1 主要儀器和設(shè)備

根據(jù)圖1和圖2的對(duì)比結(jié)果可知，無花果多糖的構(gòu)成主要有：鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖，其中葡萄糖含量最高。因此本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)糖，用于無花果多糖的含量的測(cè)定。

圖1 六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單糖GC分析

圖2 無花果多糖中單糖含量的GC分析

2.4 苯酚—硫酸法檢測(cè)無花果多糖

2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制 準(zhǔn)確稱取0.1009g的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖(105℃干燥恒重)，蒸餾水定容l00mL，再稀釋成10倍。

2.4.2 苯酚溶液的配制 處理苯酚：稱取100g 苯酚(純苯酚為針狀無色結(jié)晶)，水浴加熱后溶解，加鋁片0.10g(先用1：6 的鹽酸除去鋁片表面的氧化鋁后再稱量使用)，加氫氧化鈉0.05g，蒸餾收集182℃的餾分[7]。

80%苯酚：水：處理苯酚=1:4，避光冷藏保存。

6%苯酚：臨用前以80%苯酚配制。

2.4.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇 精密吸取0.1mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，置于10mL 具塞試管中，依次用1.0mL 蒸餾水和1.0mL 5%苯酚試液，搖勻，迅速滴加5.0mL 濃硫酸，搖勻后靜置5min，沸水浴加熱15min，取出后冷卻至室溫。同理，蒸餾水代替糖溶液配制空白。用分光光度計(jì)在450-550mn 范圍內(nèi)掃描，得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收波長(zhǎng)在490nm處。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取濃度為0.1009 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL，分別置于15mL具塞試管中，依次添加：蒸餾水至2.0mL—1.0mL 6%苯酚溶液—5.0mL 濃硫酸。之后，搖勻靜置10min，先沸水浴15min，后冷卻至室溫。用同樣方法蒸餾水配制空白，于490nm 處測(cè)定吸光值。繪制葡萄糖質(zhì)量一吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.5 換算因子的測(cè)定 精密稱取精制多糖2.2mg，蒸餾水定容100mL，搖勻，得樣品溶液。按“2.4.4”的方法測(cè)定，并由圖3中回歸方程計(jì)算出葡萄糖的含量，按公式(1)得出換算因子如下[7]。

式（1）中：W 為稱取的多糖質(zhì)量（mg），C 為精制多糖液中葡萄糖的濃度（mg/mL），D為多糖液的稀釋倍數(shù)。

取1 mL樣品液，用同樣的方法平行測(cè)定三次，取平均吸光度：A=0.1215。

代入回歸方程：Y=7.3552X+0.0029 計(jì)算出葡萄糖的質(zhì)量，再代入式（1），計(jì)算出換算因子為：f=1.375。

2.5 無花果多糖含量的測(cè)定

2.5.1 無花果提取液的準(zhǔn)備 稱取無花果粉1.0342g，20mL石油醚提取回流1h，濾渣用20 mL熱石油醚洗滌2-3 次，沸水浴提取2h，趁熱過濾，并蒸餾水定容100mL，搖勻備用。

2.5.2 無花果中多糖含量的測(cè)定 1mL 無花果提取液用蒸餾水定容250mL,作為待測(cè)液。按“2.4.4”的方法測(cè)定，代入式（2）計(jì)算樣品中多糖的含量。

式（2）中：C 為樣液中葡萄糖的濃度（mg/mL），D 為樣液的稀釋倍數(shù)，f為換算因子，W為相應(yīng)的樣品重量（g）。

取1mL待測(cè)液，按“2.4.4”的方法平行測(cè)定三次，得吸光度為：A=0.287。按上述公式計(jì)算無花果果渣中總多糖的含量為：12.8%。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精確稱取無花果粉6 份各5mg 左右（精度d=0.1mg）。按“2.5.1”的方法測(cè)定無花果多糖的含量，代入式（2）計(jì)算。

取1mL 制得的樣品溶液，按“2.4.4”的方法測(cè)其吸光度，每組平行測(cè)定3次，取其平均值，經(jīng)計(jì)算結(jié)果見表2。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取2mL 待測(cè)液，取于15mL具塞試管中，每隔30min測(cè)定一次，持續(xù)24h，考察其穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.5.5 加樣回收率的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取6份無花果粉，各5 mg 左右（精度d=0.1mg），同時(shí)對(duì)應(yīng)加入精制無花多糖，各10mg 左右。按“2.5.1”的方法制備得到樣液，再按“2.4.4”的方法測(cè)得吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表2 無花果多糖測(cè)定重現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果

表3 無花果多糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 無花果多糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 結(jié)果與討論

無花果經(jīng)過脫脂、脫蛋白質(zhì)提取分離得到的多糖，用苯酚－硫酸法測(cè)定多糖的含量。根據(jù)單糖組分的GC 分析，用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得無花果多糖的換算因子為f=1.375，測(cè)得無花果多糖的含量為12.8%。本法簡(jiǎn)單快速，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，適合于檢測(cè)柱層析收集樣品中多糖的定量分析[7]。

比色反應(yīng)中特別要注意分層現(xiàn)象[8]，一定要加入苯酚后充分搖勻，之后迅速加入硫酸，控制好比色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，沸水浴后冷卻要及時(shí)，這樣重現(xiàn)性才高。

在多糖含量測(cè)定中通常選擇單糖如葡萄糖代替為多糖對(duì)照品，系統(tǒng)誤差較大。本實(shí)驗(yàn)中一方面經(jīng)過脫脂，Sevage 法除蛋白，醇沉和超濾除去小分子雜質(zhì)，最后有機(jī)溶劑脫色[9]，得到了精制的無花果多糖。另一方面根據(jù)單糖組分的GC 分析選擇葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算出換算因子，來避免一些系統(tǒng)誤差，獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果。