馬素亞，杜相宜，時(shí)晶

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京100007

帕金森病（PD）是一種以黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性為特征的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)以運(yùn)動(dòng)癥狀為核心，伴隨一系列非運(yùn)動(dòng)癥狀，晚期可出現(xiàn)認(rèn)知和精神障礙。其病理改變主要是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元減少，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺含量降低。大腦中的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與PD的發(fā)生密切相關(guān)［1］。本研究通過(guò)總結(jié)PD相關(guān)信號(hào)通路研究文獻(xiàn)，構(gòu)建PD信號(hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并使用cytoscape拓?fù)浞治龊Y選PD信號(hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白，從細(xì)胞分子水平為PD的治療提供理論支持和研究方向。

1 資料與方法

1.1 PD相關(guān)信號(hào)通路的篩選 通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知網(wǎng)、維普、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選PD信號(hào)通路相關(guān)研究，研究類(lèi)型不限，檢索時(shí)間自各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)至2021年3月。檢索中文關(guān)鍵詞為“帕金森”和“信號(hào)通路”，英文關(guān)鍵詞為“Parkinson's disease”和“sig?naling pathway”。文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：研究類(lèi)型為臨床實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；研究疾病是PD；研究?jī)?nèi)容為信號(hào)通路。排除綜述、評(píng)論性文章、會(huì)議論文。信號(hào)通路納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)篩選后研究文獻(xiàn)篇數(shù)≥5篇。

1.2 PD相關(guān)信號(hào)通路信息圖的獲取 在對(duì)PD信號(hào)通路文獻(xiàn)檢索后，使用BioCarta Pathway、CST、PathBank信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)，下載完整信號(hào)通路信息圖。

1.3 PD信號(hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與關(guān)鍵蛋白的篩選 在信號(hào)通路文獻(xiàn)及完整信號(hào)通路圖的基礎(chǔ)上，篩選各信號(hào)通路主要蛋白，蛋白簡(jiǎn)寫(xiě)使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)矯正。將篩選出的信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，使用“Multiple proteins”選項(xiàng)，種屬限制為“Homo sapiens”。在得出結(jié)果后，導(dǎo)出.tsv格式文件至cytoscape軟件，構(gòu)建信號(hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。使用拓?fù)浞治?，得出信?hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白。

2 結(jié)果

2.1 PD信號(hào)通路篩選結(jié)果 文獻(xiàn)檢索結(jié)果中，PubMed 730篇，中國(guó)知網(wǎng)361篇，維普85篇，共1 176篇。查重刪除55篇，閱讀題目及摘要后刪除841篇，共篩選出280篇文獻(xiàn)，涉及12條PD相關(guān)信號(hào)通路。選取通路文獻(xiàn)數(shù)≥5的研究，納入信號(hào)通路包括PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路、p38 MAPK信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、SDF-1/CXCR4信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路和Nrf2/ARE信號(hào)通路。見(jiàn)表1。

2.2 PD相關(guān)信號(hào)通路信息圖 見(jiàn)OSID碼。

2.3 PD相關(guān)信號(hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖與關(guān)鍵蛋白的篩選結(jié)果 由STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的PD相關(guān)信號(hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)OSID碼。經(jīng)cytoscape拓?fù)浞治龅贸龅鞍紫嗷プ饔镁W(wǎng)絡(luò)前10位關(guān)鍵蛋白分別為AKT1、MAPK1、Jun、p53、MAPK8（JNK）、c-MYC、TNF、PTEN、STAT3、mTOR，節(jié)點(diǎn)度分別為62、57、57、56、52、50、49、44、42、41。與PD相關(guān)的信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的篩選結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

近年來(lái)PD在全球的發(fā)病率逐年上升，其增長(zhǎng)速度已超過(guò)阿爾茨海默病，預(yù)計(jì)到2040年患者人數(shù)將達(dá)到1 420萬(wàn)［15］。PD患者黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性和丟失，腦內(nèi)多巴胺生成減少，但黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞變性的機(jī)制仍不明確。分析PD相關(guān)信號(hào)通路有助于探討其發(fā)病機(jī)制，為PD的治療提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是目前研究最多的信號(hào)通路，約占PD信號(hào)通路研究文獻(xiàn)的34%，JNK通路、p38 MAPK通路、Wnt/β-catenin通路、Notch信號(hào)通路、Nrf2/ARE通路和NF-κB通路研究也較多，均為PD信號(hào)通路的熱點(diǎn)通路。

表1 PD相關(guān)信號(hào)通路篩選結(jié)果

表2 PD相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白篩選結(jié)果

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞存活、自噬、突觸可塑性、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元增殖分化等生理過(guò)程。激活PI3K/AKT/mTOR通路可阻止細(xì)胞受到凋亡刺激，減少細(xì)胞凋亡［16］。

JNK信號(hào)通路是MAPK通路的重要組成部分，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。JNK作為應(yīng)激激活蛋白激酶，可被炎癥細(xì)胞因子、熱休克以及紫外線照射等激活。激活的MAPK可作用于轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、c-MYC、ATF2及抗調(diào)亡和促調(diào)亡蛋白等，發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用［17］。

p38 MAPK信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路之一，與PD的發(fā)病密切相關(guān)。p38信號(hào)通路可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與負(fù)性刺激相關(guān)，如應(yīng)激、紫外線、滲透壓變化和細(xì)胞因子等均為其刺激因子。被激活的p38可激活多種下游信號(hào)分子，如TNF、c-MYC、p53、c-Jun、Caspase等，從而發(fā)揮促凋亡作用［18］。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是進(jìn)化過(guò)程相對(duì)保守的通路，在正常胚胎發(fā)育以及成年組織穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞分化、發(fā)育、凋亡等過(guò)程，與神經(jīng)退行性疾病如PD密切相關(guān)［19］。Wnt配體與細(xì)胞膜表面卷曲蛋白（Fz）受體及輔助性低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白結(jié)合，激活Fz受體；活化的Fz受體作用于散亂蛋白，使GSK-3β磷酸化失活，導(dǎo)致其介導(dǎo)的β-catenin降解過(guò)程受抑制，β-catenin水平升高。部分β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子結(jié)合，引起下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化，維持多巴胺神經(jīng)元的完整性［20］。

Notch信號(hào)通路具有高度保守性，在神經(jīng)退行性疾病如PD中有重要作用，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等［21］。Notch受體與鄰近細(xì)胞上的配體結(jié)合，激活信號(hào)通路，隨后Notch蛋白發(fā)生水解，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域NICD釋放入細(xì)胞質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到胞核，與胞核上的DNA結(jié)合蛋白CSL家族結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄因子，刺激靶基因轉(zhuǎn)錄，繼而調(diào)節(jié)其下游的靶點(diǎn)基因，參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生［10］。

SDF-1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及腦損傷中具有重要的調(diào)節(jié)和趨化作用，SDF-1大量地、選擇性地在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。CXCR4對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育發(fā)揮重要作用，能促使神經(jīng)元順其梯度改變發(fā)生遷移［22］。SDF-1特異性地與CXCR4受體結(jié)合，通過(guò)CXCR4促進(jìn)二聚體形成、空間構(gòu)象改變、內(nèi)化以及激活與其相偶聯(lián)的G蛋白等機(jī)制，激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［23］。

NF-κB信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答過(guò)程中起核心作用，是免疫反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。異常的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致PD患者多巴胺能神經(jīng)元丟失的主要因素之一，過(guò)度激活的NF-κB信號(hào)與PD的發(fā)病有關(guān)。在大多數(shù)細(xì)胞中，NF-κB與抑制性IκB蛋白偶聯(lián)，以不活躍的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)信號(hào)通路被激活后，IκBα磷酸化和降解，釋放NF-κB二聚體（p65∶p50）轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)［24］。

JAK/STAT通路是一條特異性的細(xì)胞膜受體從激活到核基因表達(dá)的蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)通路，可被多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及激素所激活，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化成熟、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程［25］。JAK/STAT信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致多種自身免疫性和神經(jīng)炎癥性疾病發(fā)生，如過(guò)表達(dá)α-SYN可導(dǎo)致PD［26］。JAK/STAT能夠直接調(diào)節(jié)跨膜受體與細(xì)胞核的聯(lián)系，STAT可被JAK磷酸化、二聚化，然后通過(guò)核膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)與特定的DNA元件結(jié)合來(lái)調(diào)控細(xì)胞因子應(yīng)答基因的表達(dá)［13］。

Nrf2/ARE信號(hào)通路激活是PD的重要神經(jīng)保護(hù)調(diào)節(jié)因子［27］。Nrf2是神經(jīng)元生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子，Nrf2激活后，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，啟動(dòng)抗氧化蛋白酶的表達(dá)。抗氧化蛋白酶主要包括血紅素加氧酶1（HO-1）和NADPH醌氧化還原酶1（NQO1），HO-1和NQO1高表達(dá)可延緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展［28］。Nrf2可激活多種抗氧化反應(yīng)元件（ARE）驅(qū)動(dòng)的抗氧化基因，在體外和體內(nèi)阻止氧化應(yīng)激，是神經(jīng)治療學(xué)的多功能通路［29］。

本研究采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PD相關(guān)信號(hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，經(jīng)cytoscape拓?fù)浞治龅贸龅鞍紫嗷プ饔镁W(wǎng)絡(luò)前10位關(guān)鍵蛋白分別為AKT1、MAPK1、Jun、p53、MAPK8（JNK）、c-MYC、TNF、PTEN、STAT3、mTOR。AKT又稱(chēng)蛋白激酶B，相對(duì)分子質(zhì)量為57×103，大約由480個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分為AKT1、AKT2、AKT3三種亞型。本研究結(jié)果顯示，AKT1是PD蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)最重要的蛋白。研究顯示，AKT1活性減低與PD的發(fā)病密切相關(guān)，AKT1通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用［30］。細(xì)胞凋亡是多巴胺神經(jīng)元損傷的重要原因，MAPK是神經(jīng)元凋亡的強(qiáng)效因子，其過(guò)度激活可導(dǎo)致PD神經(jīng)元死亡［31］。本研究結(jié)果顯示，MAPK1、MAPK8均與PD的發(fā)生密切相關(guān)，MAPK1參與多種細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活等，在PD病程進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用［32］。MAPK8參與神經(jīng)系統(tǒng)生理活動(dòng)的主要是c-Jun N末端激酶。活化的MAPK8在淀粉樣斑塊形成、神經(jīng)炎癥、突觸功能障礙中起重要作用，是神經(jīng)退行性疾病的重要信號(hào)因子［33］。炎癥因子TNF-α與其受體相結(jié)合可觸發(fā)并啟動(dòng)Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重PD的病理進(jìn)展。c-Jun作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控其他基因的表達(dá)，在受到外界刺激激活后，可快速表達(dá)合成Jun蛋白，而Jun蛋白是腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞活化的標(biāo)志［34］。p53是一種細(xì)胞應(yīng)激傳感器，當(dāng)p38MAPK通路激活后，可磷酸化p53，并使其核轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而發(fā)揮作用［35］。ODUMPATTA等［36］研究發(fā)現(xiàn)，MYC作為主要的轉(zhuǎn)錄因子在PD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PTEN在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，作為一種脂磷酸酶可導(dǎo)致PIP3去磷酸化變成PIP2，抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。PTEN可以調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及神經(jīng)元分化及凋亡，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［37］。研究顯示，STAT3磷酸化后可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)能促進(jìn)血管生成，為新生神經(jīng)元和突觸提供營(yíng)養(yǎng)作用［38］。mTOR是PI3K相關(guān)激酶家族成員，在自噬誘導(dǎo)中發(fā)揮具有重要作用，活化后的mTOR激酶可抑制自噬，抑制mTOR激酶活性能夠激活自噬進(jìn)程［39］。

綜上所述，本研究對(duì)PD相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行總結(jié)，利用生物信息學(xué)方法研究PD相關(guān)信號(hào)通路蛋白網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵信號(hào)蛋白，找出前10位關(guān)鍵信號(hào)蛋白為AKT1、MAPK1、Jun、p53、c-MYC、JNK、TNF、PTEN、STAT3和mTOR，從PD的細(xì)胞分子水平方面為PD的進(jìn)一步研究提供了理論支持。