司曉麗 王 燁 王 卓 李蘭珍 朱向東 （甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚不明確的慢性炎性腸病，其發(fā)病機(jī)制與環(huán)境、遺傳、免疫等因素有關(guān)［1］。疾病活動(dòng)期，腸道上皮黏膜屏障破壞，腸道內(nèi)病原體向固有層轉(zhuǎn)移，免疫細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量TNF-α、IFN-γ、IL-6等促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，連接蛋白表達(dá)下調(diào)，腸上皮通透性增加，加重組織損傷［2］。自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)半衰期蛋白質(zhì)的降解途徑，可通過降解受損的細(xì)胞器或細(xì)胞內(nèi)的病原體，修復(fù)受損的腸上皮，刺激宿主產(chǎn)生防御肽，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，被認(rèn)為是先天免疫的核心［3］。在DSS誘導(dǎo)的急性UC動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因ATG7表達(dá)下降，提示腸上皮細(xì)胞自噬功能下降，腸道內(nèi)環(huán)境被破壞，導(dǎo)致了腸道先天免疫的異常［4］。

白芍是一種常見的補(bǔ)益藥材，為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的根，芍藥苷（Paeoniflorin）是其主要的活性成分，一種單萜糖苷。本團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)芍藥苷能夠調(diào)節(jié)腸道異常免疫反應(yīng)，修復(fù)TNBS/乙醇液誘導(dǎo)的腸道潰瘍，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用［5］。也有研究報(bào)道芍藥苷能夠降低IL-17A、IL-17F及TNF-α等Th17細(xì)胞相關(guān)因子mRNA的表達(dá)，減少病變部位炎細(xì)胞浸潤(rùn)、表皮細(xì)胞增殖及異常分化［6］。IL-17是由native CD4+T細(xì)胞來源的Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種前促炎因子。Meta分析表明IL-17遺傳多態(tài)性和血清水平可能與潰瘍性結(jié)腸炎風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，患者外周血IL-17水平顯著升高，且IL-17水平與疾病病變程度顯著相關(guān)［7-8］。此外，血清剝奪或雷帕霉素（rapamycin，自噬誘導(dǎo)劑）處理的人表皮Ha?CaT細(xì)胞給予100 ng/ml人重組IL-17A刺激后，LC3Ⅱ蛋白水平顯著下降，提示自噬在IL-17A介導(dǎo)的皮膚炎癥中活性下降［9］。在潰瘍性結(jié)腸炎中，自噬與IL-17的關(guān)系鮮有報(bào)道，本研究旨在觀察IL-17及自噬相關(guān)因子LC3BⅡ、Beclin1在DSS誘導(dǎo)的UC大鼠模型中的表達(dá)水平，探討芍藥苷可能的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物70日齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，40只，體重（200±20）g（購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，No.62001000000324），飼養(yǎng)于通風(fēng)、溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（55±15）%環(huán)境，每日光照12 h，自由攝食飲水。

1.1.2 藥物與試劑DSS購(gòu)自美國(guó)MP公司；芍藥苷（批號(hào)：C10010107，含量≥98%）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；柳氮磺吡啶購(gòu)自上海信宜天平藥業(yè)有限公司；兔抗IL-17、LC3B抗體購(gòu)自GeneTex公司；兔抗Beclin1抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；IL-17、ICAM ELISA試劑盒購(gòu)自Mibo公司；TNF-αELI?SA試劑盒購(gòu)自欣博盛生物；SP免疫組化試劑盒購(gòu)自中山金橋；羊抗兔IgG二抗、β-actin單克隆抗體購(gòu)自Immuno Way公司；PBS磷酸鹽緩沖液干粉購(gòu)自Solarbio公司；水合氯醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膠體金法大便潛血檢測(cè)試劑盒購(gòu)自鄭州方欣生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 DSS誘導(dǎo)慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立 參考文獻(xiàn)［10］制作相關(guān)模型，如圖1所示，30只大鼠于第1天開始連續(xù)7 d給予添加2%DSS的蒸餾水自由飲用，隨后給予無添加的蒸餾水連續(xù)飲用14 d。如圖1所示，上述DSS+蒸餾水飲用進(jìn)行3個(gè)循環(huán)。另取10只大鼠給予無添加蒸餾水作為空白對(duì)照組。在添加DSS的蒸餾水飲用期每日觀察并記錄大鼠體重、糞便性狀及便血情況。

圖1 慢性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型建立方法Fig.1 Experimental protocol to establish rat model of chronic ulcerative colitis

1.2.2 分組和給藥 區(qū)組隨機(jī)法將30只造模成功大鼠分為DSS組、DSS+芍藥苷組和DSS+柳氮磺吡啶組，每組10只大鼠。其中，柳氮磺吡啶作為陽(yáng)性對(duì)照。按照人與動(dòng)物用藥劑量折算成大鼠用藥量，芍藥苷根據(jù)前期研究自造模后第1天開始2.5 g/（kg·d）灌胃［5］，柳氮磺吡啶0.5 g/（kg·d）灌胃，空白對(duì)照組以及DSS組給予等體積生理鹽水灌胃，隔天灌胃給藥1次，各組連續(xù)給藥干預(yù)21 d。

1.2.3 DAI評(píng)分 參照文獻(xiàn)［11］，計(jì)算各組大鼠每輪添加DSS的蒸餾水飲用后DAI的值（DAI=體重減輕指數(shù)+糞便形狀指數(shù)+便血指數(shù)），評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 DAI scoring criteria

1.2.4 ELISA法檢測(cè)外周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量 新鮮配制7%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹腔靜脈抗凝采血，2 000 r/min離心15 min，收集血漿，按照說明書要求，將血漿、ELISA試劑于室溫下平衡30 min；酶標(biāo)板中，設(shè)空白孔，孔內(nèi)加100μl標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本稀釋液；設(shè)反應(yīng)孔，每孔內(nèi)加入100μl標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，封板膠紙封住反應(yīng)孔37℃孵育90 min；洗板5次；空白孔內(nèi)加入100μl生物素化抗體稀釋液，反應(yīng)孔內(nèi)加入100μl生物素化抗體工作液，37℃繼續(xù)孵育60 min；洗板5次；空白孔加入100μl酶結(jié)合稀釋液，反應(yīng)孔內(nèi)加入100μl酶結(jié)合工作液，37℃繼續(xù)孵育30 min；洗板5次；每孔加入100μl的TMB顯色，避光37℃繼續(xù)孵育15 min；每孔加入100μl終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm讀板并記錄數(shù)據(jù)，ELISACalc.exe回歸/擬合計(jì)算軟件V0.1計(jì)算樣本IL-17、TNF-α及ICAM的含量。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織IL-17蛋白表達(dá) 取病變腸組織縱行切開，預(yù)冷生理鹽水沖洗腸道，病變嚴(yán)重段置于10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋結(jié)腸組織并連續(xù)切片，脫蠟水化，pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，5%BSA 37℃孵育30 min，加入適當(dāng)比例稀釋的一抗（IL-17 1∶100），置于4℃冰箱過夜。次日37℃復(fù)溫45 min，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染20 min，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片，Image J圖像分析軟件測(cè)定IL-17陽(yáng)性區(qū)域平均吸光度值。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)結(jié)腸組織IL-17、LC3B、Beclin1蛋白水平 取各組結(jié)腸組織剪碎，置于預(yù)冷的破璃容器中，加入裂解液制備組織勻漿，12 000 r/min離心5 min，取上清測(cè)定蛋白濃度。各組分別取等量蛋白上樣，經(jīng)電泳分離后，PVDF膜300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；加一抗（IL-17 1：2 000、LC3B 1：1 000、Beclin1 1：2 000），4℃冰箱過夜。次日，PBST洗膜4次，每次8 min；避光條件下敷二抗輕搖2 h，PBST洗膜4次，每次8 min；加ECL發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）曝光拍照，Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算IL-17、LC3B、Beclin1的相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有指標(biāo)均以±s表示，組間差異比較采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對(duì)DAI評(píng)分的影響 空白對(duì)照組大鼠飲食、飲水尚可，未見明顯體重下降及血便，偶有軟便。DSS組大鼠隨著DSS飲用時(shí)間的增長(zhǎng)，大鼠食納減少，毛色粗糙，體重顯著下降，糞便軟散或便溏，次數(shù)增加，肛周污濁，嚴(yán)重者肉眼可見血便，未出現(xiàn)死亡，DAI評(píng)分結(jié)果見表2，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，DAI評(píng)分顯著增高（P＜0.01）。與DSS組大鼠相比，治療組大鼠DAI評(píng)分顯著降低（P＜0.05），食納及體重增加，便溏及血便減少。

表2 各組大鼠DAI評(píng)分（±s，n=10）Tab.2 DAI scores of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠DAI評(píng)分（±s，n=10）Tab.2 DAI scores of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.01.

Third round 0.3±0.93）9.7±2.02）4.1±2.92）3）3.5±2.42）3）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine First round 0.4±0.83）4.7±1.62）2.4±1.72）3）1.9±1.31）3）Second round 0.5±1.13）7.8±1.82）3.8±2.12）3）3.2±1.92）3）

2.2 芍藥苷對(duì)外周血IL-17、TNF-α及ICAM含量的影響ELISA結(jié)果如表3所示：與空白對(duì)照組相比，DSS組大鼠外周血中IL-17、TNF-α及ICAM含量顯著升高（P＜0.01）。與DSS組相比，DSS+芍藥苷組、DSS+柳氮磺吡啶組大鼠外周血IL-17、TNF-α及ICAM含量顯著降低（P＜0.05）。

表3 ELISA檢測(cè)外 周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量（±s，n=10）Tab.3 Levels of IL-17，TNF-αand ICAM in peripheral blood were detected by ELISA（±s，n=10）

表3 ELISA檢測(cè)外 周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量（±s，n=10）Tab.3 Levels of IL-17，TNF-αand ICAM in peripheral blood were detected by ELISA（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

ICAM（pg/ml）107.4±10.44）212.5±11.52）151.3±19.81）4）128.4±16.51）4）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine IL-17（pg/ml）71.6±7.44）135.3±13.72）94.2±10.11）4）81.0±15.94）TNF-α（pg/ml）68.3±9.14）119.3±15.12）95.7±19.01）3）83.5±19.44）

2.3 芍藥苷對(duì)大鼠結(jié)腸組織IL-17蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果如圖2所示，IL-17陽(yáng)性表達(dá)主要見于黏膜層細(xì)胞的胞漿內(nèi)，細(xì)胞間質(zhì)及細(xì)胞核未見明顯表達(dá)。Image J圖像分析軟件結(jié)果如表4所示，與空白對(duì)照組相比，DSS組大鼠結(jié)腸組織IL-17陽(yáng)性區(qū)域吸光度值顯著增加（P＜0.01）。與DSS組相比，DSS+芍藥苷組、DSS+柳氮磺吡啶組大鼠結(jié)腸組織IL-17陽(yáng)性區(qū)域吸光度值顯著降低（P＜0.01）。

圖2 免疫組化測(cè)定芍藥苷對(duì)結(jié)腸組織IL-17蛋白表達(dá)水平的影響（×200）Fig.2 Effect of paeoniflorin on expression of IL-17 pro-tein in colon tissues was determined by immunohis-tochemistry（×200）

表4 結(jié)腸組織IL-17陽(yáng)性區(qū)域吸光度值（±s，n=10）Tab.4 Absorbance value of IL-17 positive area in colon-tissue（±s，n=10）

表4 結(jié)腸組織IL-17陽(yáng)性區(qū)域吸光度值（±s，n=10）Tab.4 Absorbance value of IL-17 positive area in colon-tissue（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；Compared with DSS group，3）P＜0.01.

Absorbance value 0.273±0.0783）0.354±0.0312）0.251±0.1093）0.237±0.0241）3）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine

2.4 芍藥苷對(duì)大鼠結(jié)腸組織IL-17、LC3B、Beclin1蛋白水平的影響Western blot結(jié)果如圖3、表5所示，與空白對(duì)照組相比，DSS組結(jié)腸組織IL-17蛋白水平顯著增加，LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平降低（P＜0.01）；與DSS組相比，DSS+芍藥苷組和DSS+柳氮磺吡啶組結(jié)腸組織IL-17蛋白水平顯著降低（P＜0.01），LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平增加（P＜0.05）。

圖3 IL-17、LC3BⅡ及Beclin1在各組大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colin tissues of rats in each group

表5 Western blot檢測(cè)結(jié)腸組織IL-17、LC3BⅡ及Beclin1的相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=10）Tab.5 Relative expression levels of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colon tissues were detected by Western blot（±s，n=10）

表5 Western blot檢測(cè)結(jié)腸組織IL-17、LC3BⅡ及Beclin1的相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=10）Tab.5 Relative expression levels of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colon tissues were detected by Western blot（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

Beclin1/β-actin 0.347±0.0444）0.239±0.0302）0.321±0.0402）3）0.469±0.0591）4）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine IL-17/β-actin 0.869±0.0354）1.247±0.0182）0.974±0.0231）4）0.841±0.0314）LC3Ⅱ/β-actin 1.050±0.0344）0.742±0.0262）0.878±0.0422）3）0.917±0.0211）4）

3 討論

目前，關(guān)于UC的病因與發(fā)病機(jī)制，研究普遍認(rèn)為環(huán)境因素（傳染病、藥物、飲食、壓力等）作用于遺傳易感者，在腸道菌群的參與下，腸道先天免疫異常導(dǎo)致適應(yīng)性免疫紊亂（Th1/Th2調(diào)節(jié)失衡和Th17/Treg轉(zhuǎn)化失衡），炎性因子分泌，反向增加先天免疫損傷，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生［2］。IL-17家族通常被認(rèn)為是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁［12］，其與受體結(jié)合后，可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）以及核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等信號(hào)通路刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、TNF-α、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（granulocyte-macrophage colonystimulating factor，GM-CSF）、細(xì)胞間黏附分子-1（in?tercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）等細(xì)胞因子和CXCL-1、CXCL-6及CXCL-8等趨化因子，進(jìn)而導(dǎo)致單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞募集及炎癥的產(chǎn)生［13-14］。

DSS是一種人工合成的硫酸鹽多糖，動(dòng)物經(jīng)多個(gè)循環(huán)自由飲用可誘發(fā)以血便、黏膜潰瘍、炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理改變的慢性潰瘍性結(jié)腸炎，其作用機(jī)制可能與腸道菌群失調(diào)、腸道上皮細(xì)胞增殖受抑制、破壞腸道黏膜屏障、巨噬細(xì)胞功能障礙等有關(guān)，其與人類UC病理改變接近［10］。本研究結(jié)果顯示芍藥苷治療后，DSS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子IL-17、TNFα、ICAM的含量及IL-17蛋白表達(dá)降低，表明芍藥苷能夠緩解DSS對(duì)腸道的炎癥反應(yīng)。

有報(bào)道顯示，在肺上皮細(xì)胞中IL-17A通過激活GSK-3β通路抑制自噬，給予IL-17A阻斷劑則可激活自噬而減輕小鼠肺纖維化［15］。在人HaCaT細(xì)胞中，IL-17A同樣可以下調(diào)LC3Ⅱ的表達(dá)，其機(jī)制可能與上調(diào)自噬負(fù)性調(diào)節(jié)因子mTOR信號(hào)通路有關(guān)。然而，IL-17與自噬在UC中的關(guān)系鮮有報(bào)道。LC3/Atg8是較為廣泛應(yīng)用于檢測(cè)自噬體的標(biāo)志分子，LC3Ⅱ水平或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映細(xì)胞自噬的活性［16］。Beclin1/Atg6是ClassⅢPI3K復(fù)合物的組成部分，涉及自噬體的形成［17］。本研究Western blot結(jié)果可見，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平顯著低于空白對(duì)照組，結(jié)合已有研究報(bào)道顯示自噬缺陷可能在炎癥性腸病中起重要作用［18-19］。芍藥苷治療后，LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平增加，提示芍藥苷可能通過上調(diào)自噬水平減輕DSS對(duì)大鼠腸道的損傷。

本研究?jī)H對(duì)IL-17及自噬相關(guān)蛋白LC3B、Be?clin1在DSS誘導(dǎo)的UC大鼠模型中的表達(dá)情況進(jìn)行了觀察，而在UC中IL-17通過何種信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬以及自噬在UC發(fā)病機(jī)制中的作用將是今后工作的重點(diǎn)。