胡雅晴,武云云,李兵,李奚

金納米棒對小鼠乳腺癌細(xì)胞光熱/光動力協(xié)同治療的研究

胡雅晴,武云云,李兵,李奚*

長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 吉林 長春 130012

為研究金納米棒（Au NRs）對小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）光熱/光動力協(xié)同治療的影響。首先，通過調(diào)節(jié)硝酸銀溶液（AgNO3）的加入量，制備6種不同長徑比、不同表面電荷的Au NRs 1~6。然后，通過光熱升溫實驗和細(xì)胞內(nèi)/外ROS生成實驗對Au NRs的光熱和光動力性質(zhì)評估，并對光誘導(dǎo)細(xì)胞損傷分子機制探究。結(jié)果表明，在NIR激光的照射下，Au NRs具有相似的溫度升高水平，并顯示出良好的光熱性能。關(guān)于光動力學(xué)性質(zhì)，細(xì)胞毒性評估表明，Au NRs在不同表面電荷的影響下對4T1細(xì)胞具有不同的殺傷效果。表面電荷的強度使Au NRs具有不同程度的細(xì)胞內(nèi)在化和ROS生成能力，從而引起細(xì)胞損傷。因此，Au NRs對癌細(xì)胞具有光熱/光動力協(xié)同治療的作用，在癌細(xì)胞的光治療方面，顯示出巨大的潛力。

金納米棒; 乳腺癌; 協(xié)同治療

癌癥已成為世界面臨的最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。研究人員一直在努力開發(fā)更準(zhǔn)確快速的診斷策略和有效的治療方法來對抗癌癥。近年來，各種類型的納米材料已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，特別是光敏納米材料在癌癥光治療中的應(yīng)用。作為光治療最有效的方法，光動力療法（PDT）和光熱療法（PTT）都是利用光敏劑吸收光能對目標(biāo)組織進(jìn)行治療[1]。在PTT中，光敏劑在特定波長的光照射后，可以選擇性地局部加熱，并利用熱量引起癌細(xì)胞或組織損傷。然而在PDT中，光敏劑在光照后變得不穩(wěn)定并且可以吸收能量，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的過程中能量被轉(zhuǎn)移到周圍的氧分子或基質(zhì)中，這種能量的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致形成了活性氧（ROS），例如超氧化物（O2?-），羥基自由基（HO?）和單線態(tài)氧（1O2）。而過量的ROS會觸發(fā)細(xì)胞損傷，并最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[2]。

金納米材料具有獨特的光學(xué)性能和理想的生物相容性。金納米棒（Au NRs）具有良好的可控的表面化學(xué)性質(zhì)和強大的局部表面等離子體共振（LSPR），在近紅外（NIR）光區(qū)（650~900 nm）中具有很強的吸收和散射作用。當(dāng)暴露在近紅外激光下時，Au NRs附近的入射光的場效應(yīng)得到增強，并且LSPR譜帶中的自由電子會感覺到電場的存在并開始振蕩，之后高能量電荷通過化學(xué)和能量轉(zhuǎn)換過程促進(jìn)和增強ROS的產(chǎn)生[3]。由于在電子-聲子弛豫過程中釋放的熱量，金納米棒結(jié)構(gòu)具有光熱特性[4]。金納米棒可以在近紅外激光照射下同時顯示出PTT和PDT的性能，實現(xiàn)精確的協(xié)同治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所用化學(xué)試劑購自Simga公司。4T1細(xì)胞購自ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶-EDTA，青霉素和鏈霉素購自Merck Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 Au NRs 1~6的合成在形狀導(dǎo)向表面活性劑CTAB的存在下，通過種子生長法合成Au NRs[5]。其中，通過改變AgNO3溶液的體積得到六種不同長徑比的Au NRs 1~6。

1.2.2 Au NRs的光熱性質(zhì)測定將含有1 mL 100 μg?mL-1Au NR 1~6的石英比色皿暴露于的808 nm激光（0.75 W·cm-2，10 min，下同）下，記錄溶液的溫度變化

1.2.3 Au NRs的光動力性質(zhì)測定使用2',7'-二氯熒光素（DCF）熒光確定總ROS[6]的生成。測定490 nm激發(fā)下的DCF熒光發(fā)射光譜（波長范圍500~600 nm）。

1.2.4 細(xì)胞攝取實驗通過電感耦合等離子體光譜（ICP-OES）表征4T1細(xì)胞對Au NRs 1~6的內(nèi)吞能力。

1.2.5 細(xì)胞在光照/非光照條件下活性檢測通過MTT法分析評估4T1細(xì)胞的活力。

1.2.6 細(xì)胞活/死染色將細(xì)胞與Au NRs 1~6共同孵育，在有/無808 nm激光照射下，用鈣黃綠素-AM和碘化丙啶（PI）染色，并通過熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 蛋白質(zhì)印記分析血紅素加氧酶-1(HO-1)和熱休克蛋白(HSP 70)的表達(dá)將細(xì)胞與Au NRs 1~6共同孵育，在有/無808 nm激光照射下，裂解細(xì)胞提取蛋白。通過Bradford方法測定蛋白質(zhì)含量。通過SDS-PAGE電泳和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測目標(biāo)蛋白。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測細(xì)胞與Au NRs 1~6共同培養(yǎng)，在有/無808 nm激光照射下，加入H2DCFDA在37 °C條件下孵育。收集細(xì)胞并使用FACS-Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.9 檢測線粒體膜電位和超氧化物的產(chǎn)生細(xì)胞和Au NRs 1~6共同孵育，在有/無808 nm激光照射下，用Hoechst 33258對細(xì)胞核染色，并用JC-1和Mitosox Red對細(xì)胞染色。在Olympus BX-51光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 Au NRs 1~6的合成及理化性質(zhì)的表征

Au NRs 1~6的形貌由SEM圖像表征，Au NRs 1~6的長徑比（AR）分別為2.9，3.4，3.6，3.7，3.9和4.2（見圖1-A~F）。由圖1（G）可見，通過調(diào)節(jié)AgNO3的體積，將Au NRs 1~6的縱向LSPR峰調(diào)整為750 nm~900 nm。Zeta電勢表征溶液中納米系統(tǒng)的表面電荷和穩(wěn)定性，由圖1（H）可見，Au NRs 1~6的負(fù)表面電荷分別為37.9±4.3、48.4±2.6、59.7±4.4、45.2±3.6、39.9±2.9和35.9±2.1。

圖 1 Au NRs 1~6的SEM圖像（A~F）、Au NRs 1~6的UV-Vis光譜（G）、Au NRs 1~6的 Zeta電位（H）

2.2 對Au NRs 1~6的光熱性能的分析

由圖2可見，Au NRs 1~6的溫度在照射808 nm激光后迅速升高，溫度升高（ΔT）分別為36.3、36.1、35.8、35.9、35.8和36.4 °C，顯示出良好的光熱性能。但是，沒有Au NRs存在時，水的溫度僅升高4.0 °C。

圖 2 Au NRs 1~6的溫度升高曲線（A）、加熱/冷卻曲線（B）

2.3 對Au NRs 1~6的光動力性質(zhì)的分析

當(dāng)沒有808 nm激光照射時，Au NRs 1~6都不會增加DCF的熒光強度，表明納米粒子沒有使ROS產(chǎn)生（見圖3-A）。但808 nm激光照射后，在Au NRs 1~6中檢測到DCF的熒光強度顯著增加，表明Au NRs中產(chǎn)生了大量的ROS（見圖3-B）。

圖 3 Au NRs 1~6的ROS生成能力無808 nm激光照射（A）、有808 nm激光照射（B）

2.4 Au NRs 1~6的體外光治療效果的驗證

如圖4（A）所示，Au NRs 3由于攜帶最多的正電荷，被細(xì)胞吸收的程度更高。通過MTT評估Au NRs 1~6的體外治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不用NIR激光照射時，所有Au NRs在細(xì)胞中均未顯示毒性（見圖4-B）；但是，NIR激光照射后，Au NRs 1~6使細(xì)胞活力大大降低（見圖4-C）?；?死細(xì)胞染色分析獲得了與MTT一致的結(jié)果（見圖4-D）。其中，Au NR 3顯著降低了4T1細(xì)胞的活力，顯示出最強的細(xì)胞損傷作用，主要是由于Au NR 3的Zeta電位引起更強的細(xì)胞內(nèi)在化。由此可得，Au NRs 1~6的光治療效果與光熱/光動力性質(zhì)一致，證明細(xì)胞吸收的納米粒子數(shù)量對光治療效果有重要影響。

圖 4 細(xì)胞對Au NRs 1~6的攝?。ˋ）、無NIR激光照射下4T1細(xì)胞的存活率（B）、有NIR激光照射下4T1細(xì)胞的存活率（C）、細(xì)胞活/死染色分析（D）

2.5 Au NRs光誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的分子機制

如圖5所示，沒有近紅外激光照射時，Au NRs 1~6不能誘導(dǎo)HSP 70和HO-1的表達(dá)（見圖5A），在細(xì)胞內(nèi)也沒有檢測到DCF熒光（見圖5C），更不會引起線粒體功能障礙（見圖5E）；但在近紅外激光照射下，所有Au NRs都觸發(fā)了HSP 70和HO-1的表達(dá)（見圖5B），過量ROS的生成致使DCF產(chǎn)生熒光（見圖5D），同時引發(fā)的線粒體超氧化物的產(chǎn)生和線粒體膜的去極化顯著增加，其中Au NRs 3表現(xiàn)出最強的細(xì)胞殺傷效果。

圖 5 膜電位和線粒體超氧化物的產(chǎn)生

3 討論

在本研究中，改變AgNO3的添加量以控制Au NRs的長徑比，并通過種子介導(dǎo)的方法合成了6個不同的Au NRs。在Au NRs中，CTAB形成帶電頭基朝外的雙層結(jié)構(gòu)，使得Au NRs帶正電，因此它們能在水溶液中穩(wěn)定存在[7]。細(xì)胞對納米顆粒的吸收可以看作是其與細(xì)胞膜結(jié)合和內(nèi)在化的兩個過程[8]。細(xì)胞膜主要由磷脂雙分子層和帶負(fù)電的蛋白質(zhì)組成，可促進(jìn)帶正電的Au NRs靜電吸附到細(xì)胞膜上，這表明細(xì)胞攝取帶正電的金納米粒子的程度高于相應(yīng)的陰離子納米顆粒[9]。而具有不同長徑比的Au NRs帶有不同量的正電荷，受細(xì)胞表面帶負(fù)電荷糖衣[10]的影響，六種Au NRs的細(xì)胞內(nèi)化程度不同。根據(jù)細(xì)胞對Au NRs的不同攝取，在808 nm的近紅外激光照射下檢測了它們的PDT / PTT性能，并驗證了它們在4T1細(xì)胞中的光治療效果。

4 結(jié)論

綜上所述，在808 nm激光照射下，Au NRs具有相似的溫度升高水平，表現(xiàn)出較好的光熱性能。而對于光動力學(xué)性質(zhì)，所有這些金納米結(jié)構(gòu)在NIR激光激活下，都對4T1細(xì)胞表現(xiàn)出氧化應(yīng)激損傷。其中Au NRs 3具有最強的細(xì)胞內(nèi)在化程度和最高的ROS生成能力，從而引起最嚴(yán)重的細(xì)胞損傷。六種不同長徑比的Au NRs在近紅外激光照射下，都具有良好的光治療效果，并具有優(yōu)異的生物相容性，表現(xiàn)出巨大的腫瘤治療的潛力。

[1] Feng YL, Chang Y, Sun XJ,Differential photothermal and photodynamic performance behaviors of gold nanorods, nanoshells and nanocages under identical energy conditions [J]. Biomaterials Science, 2019,7:1448-1462

[2] Murakami T, Nakatsuji H, Inada M,Photodynamic and photothermal effects of semiconducting and metallic-enriched single-walled carbon nanotubes [J]. Journal of the American Chemical Society, 2012,134(43):17862-17865

[3] Gao L, Ru L, Gao FP,Plasmon-Mediated Generation of Reactive Oxygen Species from Near-Infrared Light Excited Gold Nanocages for Photodynamic Therapy in Vitro [J]. ACS Nano, 2014,8(7):7260-7271

[4] Alkilany AM, Thompson LB, Boulos SP,Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2012,64(2):190-199

[5] Nikoobakht B, El-Sayed MA. Preparation and Growth Mechanism of Gold Nanorods (NRs) Using Seed-Mediated Growth Method [J]. Chemistry of Materials, 2003,15(10):1957-1962

[6] Rushton EK, Jiang JK, Leonard SS,Concept of Assessing Nanoparticle Hazards Considering Nanoparticle Dosemetric and Chemical/Biological Response Metrics [J]. Journal of Toxicology & Environmental Health, 2010,73(5-6):445-461

[7] Nikoobakht B, El-Sayed MA. Evidence for bilayer assembly of cationic surfactants on the surface of gold nanorods [J]. Langmuir, 2001,17(20):6368-6374

[8] Fr?hlich E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles [J]. International Journal of Nanomedicine, 2012,7:5577-5591

[9] Wang LM, Liu Y, Li W,Selective targeting of gold nanorods at the mitochondria of cancer cells: implications for cancer therapy [J]. Nano Letters, 2010,1(2):772-780

[10] Hauck TS, Ghazani AA, Chan WCW. Assessing the effect of surface chemistry on gold nanorod uptake, toxicity, and gene expression in mammalian cells [J]. Small, 2008,4(1):153-159

Study on the Photothermal/Photodynamic Synergistic Therapy for Breast Cancer Cells from Mice by Gold Nanorods

HU Ya-qing, WU Yun-yun, LI Bing, LI Xi*

130012,

To study the effect of gold nanorods (Au NRs) on the photothermal/photodynamic synergistic treatment of mouse breast cancer (4T1) cells. First, six Au NRs with different aspect ratios and surface charges were prepared by adjusting the amount of silver nitrate solution (AgNO3). Secondly, the photothermal and photodynamic properties of Au NRs were evaluated through the photothermal heating experiment and the intracellular/extracellular ROS generation experiment, and the molecular mechanism of light-induced cell damage was explored. The results show that under the irradiation of NIR laser, Au NRs have a similar temperature rise level and show good photothermal performance. Regarding the photodynamic properties, the cytotoxicity evaluations show that Au NRs have different killing effects on 4T1 cells under the influence of different surface charges. The strength of the surface charge makes Au NRs have varying degrees of cell internalization and ROS generation capabilities, which can cause cells damage. Comprehensive analysis shows that Au NRs has a photothermal/photodynamic synergistic therapy effect on cancer cells, and shows great potential in the phototherapy of cancer cells.

Gold nanorods; breast cancer; synergistic therapy

Q599

A

1000-2324(2021)02-0247-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.015

2020-10-14

2020-11-25

胡雅晴(1996-),女,碩士研究生,研究方向:生物納米材料. E-mail:424705772@qq.com

Author for correspondence. E-mail:xli@ccut.edu.cn