白澤珍，楊美紅，趙祥

(1.山西農(nóng)業(yè)大學化學生態(tài)研究所，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，山西 太谷 030801)

植物揮發(fā)性物質(zhì)是植物在不同的生長發(fā)育時期，由表面或器官內(nèi)部貯存點散發(fā)出來的化學物質(zhì)。它的相對分子量一般在100～200，沸點低于340℃，主要包括醇類、醛類、酮類、酯類、有機酸類、萜烯類和芳香族類化合物等，并以一定的比例組成不同植物種的化學指紋圖[1-3]。近年來，隨著對植物揮發(fā)物研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它們在生態(tài)系統(tǒng)中的作用越來越突出，已經(jīng)引起了極大的關注[4-5]，例如研究證明植食性昆蟲都可以通過感受植物揮發(fā)物來尋找和選擇寄主植物，植物則通過釋放揮發(fā)物來干擾害蟲定位和抵御昆蟲取食[6]。目前，國內(nèi)外已報道了多種豆科植物的揮發(fā)性成分[7-9]，劉健等[10]借助固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術，對健康、蚜蟲為害和機械損傷的大豆(Glycinemax)的揮發(fā)物進行了提取和組分分析，共檢測出31種揮發(fā)性化學物質(zhì)；李存滿等[11]采用水蒸氣蒸餾法提取得到了紫花苜蓿(Medicagosativa)揮發(fā)油的43種揮發(fā)物，并找到5種主要化學成分；郭淑政等[12]采用炭阱吸附裝置對利馬豆(Phaseoluslunatus)的揮發(fā)物進行了收集，并采用內(nèi)標法對其揮發(fā)性有機物進行了初步的定量。但目前尚未見對扁蓿豆(Medicagoruthenica)、黑豆(black soybean)、野大豆(Glycinesoja)的揮發(fā)物成分及其相對含量的相關研究報道。因此，本研究以上述3種豆科植物為試材，采用目前最常用的動態(tài)頂空吸附法(dynamic headspace adsorption，DHA)和固相微萃取法(solid-phase microextraction，SPME)，對這3種植物揮發(fā)物進行收集，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技術進行揮發(fā)物的鑒定，對比分析不同收集方法對相同植物揮發(fā)物種類和相對含量的影響，探索豆科植物揮發(fā)物的化學組成，進而篩選豆科植物中引誘昆蟲的活性物質(zhì)，為進一步開發(fā)豆科植物防治害蟲的植物源引誘劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試植物

供試的扁蓿豆采自山西農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院試驗田，黑豆和野大豆采自山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院實驗站。

1.2 儀器設備

試驗所用儀器設備有大氣采樣儀(KDY-1.5A，鹽城市科源電子儀器有限公司)；吸附管(一端尖口的玻璃吸附管，外徑0.8 cm，內(nèi)徑0.6 cm，長14.7 cm)；熱風筒(BKL-4160，貝克洛1600 W數(shù)顯)；氣體流量計(LZM-6T，廣州永城機電設備)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Scientific TRACE 1300-TRACE ISQ)；全自動固相微萃取裝置(85 μm聚丙烯酸酯PA固相微萃取萃取頭，美國Supelco公司)；美國烤雞袋(Oven Bags，482 mm×596 mm)；Porapak Q 80-100目吸附劑(美國Waters公司)；聚四氟乙烯管(50 mm× 80 mm)；硅膠連接管(65 mm× 80 mm)。

1.3 揮發(fā)物的采集方法

1.3.1 動態(tài)頂空吸附法 于2019年7月10-25日，選擇晴朗無風的天氣，對扁蓿豆、黑豆和野大豆3種豆科植物根部以上莖葉進行揮發(fā)物采集。采樣時間統(tǒng)一在8∶00～12∶00，以避免環(huán)境日變化引起的干擾。每種植物都隨機采集3次作為平行樣，以采樣袋內(nèi)不套入植物做對照。

試驗前首先對吸附劑和硅膠進行活化[13]，然后在試驗大田中使用自制的動態(tài)循環(huán)吸附裝置，按大氣采樣儀(出氣口)→硅膠→活性炭→套袋植物→吸附管→氣體流量計→大氣采樣儀(進氣口)的順序用無味的聚四氟乙烯管和硅膠連接管連成密閉系統(tǒng)[14]。具體試驗步驟為：(1)抽氣：選取長勢良好的植株用美國烤雞袋罩住并綁緊，在短時間內(nèi)使用大氣采樣儀將袋內(nèi)空氣抽出；(2)充氣：經(jīng)過硅膠和活性炭雙重過濾的潔凈空氣充入袋中(大氣采樣儀泵入氣體流量為1 L/min)，待收集袋中充滿干凈空氣后，保持30 min；(3)采氣：在袋的另一端按裝置連接順序連接吸附管和大氣采樣儀(大氣采樣儀泵出氣體流量為500 mL/min)，開始循環(huán)采樣。4 h后拔出吸附管，使用3 mL色譜級正己烷洗脫至2 mL棕色進樣瓶中(為減少樣品成分的損失，洗脫時間控制在2 min)，氮氣吹掃濃縮至0.5 mL，密封保存于4℃冰箱備用[15]。

1.3.2 固相微萃取法 分別選擇長勢良好的3種植物采集株，蒸餾水沖洗干凈后用大濾紙吸干水分并剪碎，分別稱取各植物樣品2 g放入20 mL頂空進樣瓶中，然后置于GC-MS聯(lián)用儀中進行分析，各植物均在相同條件下進行3次重復測定[16]。

1.3.3 揮發(fā)物成分的鑒定 用GC-MS對上述收集到的植物揮發(fā)物進行分析和鑒定。GC條件：毛細管柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm，5% Phenyl Methylpolysiloxane)；進樣口溫度250℃；程序升溫：開始溫度40℃保持3 min，以6℃/min增溫至160℃保持1 min，再以20℃/min的速率升至250℃，保持5 min。載氣：高純氮氣，流速1.0 mL/min；不分流進樣，進樣量為1 μL。MS條件：傳輸線溫度280℃，四級桿溫度150℃，離子源溫度280℃，；電離方式為EI；離子化能量70 eV；數(shù)據(jù)獲得通過全掃描，掃描范圍45～550 amu?；衔镨b定通過NIST 2.0質(zhì)譜庫自動檢索分析組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，兼顧色譜保留時間并參考標準圖譜對全部檢索結果進行核對補充；定量分析采用峰面積歸一化法確定各成分的相對含量。

單一組分百分含量(%)=(單一組分的峰面積/揮發(fā)物總面積)×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行分析，用單因素ANOVA檢驗，并用Duncan氏多重比較分析差異顯著性，使用Origin 8.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 3種豆科植物揮發(fā)物成分及相對含量

利用GC-MS對2種方法(DHA和SPME法)收集的扁蓿豆、黑豆、野大豆3種豆科植物揮發(fā)物成分進行分析，并獲得相應的色譜圖(圖1)?？鄢镜卓諝怆s質(zhì)、乙醇及其他干擾成分。因動態(tài)頂空吸附法采用溶劑洗脫后液體進樣，故扣除保留時間位于前3 min以溶劑為主的干擾成分。工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行面積歸一化法處理，確定3種植物揮發(fā)物的化合物成分及其相對百分含量。

圖1 3種豆科植物揮發(fā)物成分總離子流色譜Fig.1 TIC of VOCs from three legume species注：Ⅰ、ⅰ ：扁蓿豆； Ⅱ、 ⅱ ：黑豆； Ⅲ、 ⅲ ：野大豆；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ：動態(tài)頂空吸附法；ⅰ、ⅱ、ⅲ：固相微萃取法，下同

2.1.1 動態(tài)頂空吸附法(DHA)收集的揮發(fā)物成分分析 經(jīng)GC-MS分析，DHA法收集的3種豆科植物揮發(fā)物共有45種，其中，扁蓿豆33種，黑豆18種，野大豆16種(表1)。扁蓿豆中主要成分為3,4-二甲基苯乙酮(19.17%)、4-乙基苯甲醛(18.61%)、4-異丙基苯甲醇(9.55%)等；黑豆中主要成分為四十四烷(25.84%)、3,4-二甲基苯乙酮(22.14%)、4-乙基苯甲醛(13.96%)等；野大豆中主要成分為3,4-二甲基苯乙酮(40.54%)、4-乙基苯甲醛(19.84%)、1-辛烯-3-醇(7.63%)等。DHA法收集到3種豆科植物的6種共有組分為：4-乙基苯甲醛、乙酸葉醇酯、4-異丙基苯甲醇、3,4-二甲基苯乙酮、4-乙基苯丙酮和1,4-二乙酰苯。

2.1.2 固相微萃取法收集的揮發(fā)物成分及相對含量 經(jīng)GC-MS分析，SPME法收集的3種豆科植物揮發(fā)物共有44種，其中，扁蓿豆24種，黑豆24種，野大豆22種(表2)。扁蓿豆中主要成分為葉醇(22.77%)、乙酸葉醇酯(15.48%)、2-乙基己醇(14.60%)等；野大豆中主要成分為1-辛烯-3-醇(21.28%)、乙酸葉醇酯(17.77%)、2-已烯醛(13.35%)等。SPME法收集到3種豆科植物的6種共有組分，其在各植物中均有較高含量，分別為1-辛烯-3-醇、3-辛酮、辛醇、芳樟醇、4-乙基苯甲醛和乙酸葉醇酯。

表2 固相微萃取法收集的3種豆科植物揮發(fā)物成分及相對含量

2.1.3 2種方法收集的3種植物揮發(fā)物成分比較 用2種方法收集3種豆科植物揮發(fā)物，每種植物中均存在相同成分(表3)。其中，2種方法收集的扁蓿豆揮發(fā)物中包括6種相同成分；黑豆揮發(fā)物中包括3種相同成分；野大豆揮發(fā)物中包括4種相同成分。用DHA和SPME法收集的3種豆科植物揮發(fā)物中均檢測到乙酸葉醇酯和4-乙基苯甲醛這2種化合物。在3種植物中，采用DHA法收集的4-乙基苯甲醛相對含量均高于SPME法的收集結果。

2.2 2種方法收集的3種植物揮發(fā)物種類

在扁蓿豆中，2種方法收集的揮發(fā)物主要包括醇類12種、醛類6種、酸類1種、酯類5種、酮類6種、萜類3種、烴類17種。其中，DHA法收集的揮發(fā)物中酮類揮發(fā)物相對含量最高(25.41%)，其次為醛類(20.10%)和醇類(19.20%)；SPME法收集的揮發(fā)物中醇類相對含量極高，占總相對含量的54.96%，酯類次之(18.56%)，酮類揮發(fā)物的相對含量(9.36%)約為酯類的1/2。DHA法收集的扁蓿豆揮發(fā)物中不存在任何酸類物質(zhì)，SPME法收集結果中有1種酸類化合物，且含量最少，僅占總相對含量的0.29%。

在黑豆中，2種方法收集的揮發(fā)物主要包括醇類13種、醛類8種、酸類1種、酯類4種、酮類6種、萜類1種、烴類6種。其中，DHA法收集的黑豆揮發(fā)物中沒有酸類和萜類物質(zhì)，烴類相對含量最高(31.24%)，其次為醛類(30.00%)和酮類(27.15%)。SPME法的收集結果中相對含量較高的兩類物質(zhì)為醇類(34.80%)和醛類(23.67%)，其余5類物質(zhì)相對含量較低。

表3 2種方法收集的扁蓿豆、黑豆和野大豆的共有成分

在野大豆中，2種方法收集的揮發(fā)物包括醇類12種、醛類4種、酸類2種、酯類3種、酮類3種、萜類1種、烴類9種。其中，DHA法收集的野大豆揮發(fā)物中，酮類物質(zhì)(42.97%)相對含量最高，醇類(20.34%)和醛類(20.28%)次之，該方法未收集到酸類和萜類成分。在SPME法收集結果中，野大豆醇類揮發(fā)物(35.47%)含量最高，其次為酯類(25.97%)和醛類(21.50%)；酮類物質(zhì)含量較少，僅占2.04%。該方法收集到2種酸類(0.92%)和1種萜類(0.12%)化合物，但是含量均不足1%。

綜合分析，扁蓿豆揮發(fā)物的主要成分為酮類和醇類物質(zhì)，黑豆揮發(fā)物的主要成分為醛類物質(zhì)，野大豆揮發(fā)物以醇類和醛類為主要成分(圖2)。

圖2 DHA 和SPME法收集3種豆科植物揮發(fā)物的相對含量Fig.2 Relative content of VOCs in three legume species by DHA and SPME

3 討論

植物種類、年齡、生理狀態(tài)、空間分布、季節(jié)、溫度、濕度、光照，以及生物脅迫(昆蟲、致病菌等)都可影響植物揮發(fā)物的組成[17]，且不同的揮發(fā)物收集方法也會影響試驗結果。本研究通過動態(tài)頂空吸附法和固相微萃取法收集扁蓿豆、黑豆、野大豆3種豆科植物的揮發(fā)物成分，分別檢測出扁蓿豆揮發(fā)物51種(DHA法：33種，SPME法：24種，有6種相同化合物)；黑豆揮發(fā)物39種(DHA法：18種，SPME法：24種，有3種相同化合物)；野大豆揮發(fā)物34種(DHA法：16種，SPME法：24種，有4種相同化合物)。其中，僅乙酸葉醇酯和4-乙基苯甲醛為3種豆科植物的共有化合物，使用2種方法均可在3種豆科植物中檢測到。張靜靜等[16]采用固相微萃取法對豆科牧草紫花苜蓿不同部位進行揮發(fā)物收集，乙酸葉醇酯為其葉、莖、花三個部位揮發(fā)物中的一種共有化合物；4-乙基苯甲醛僅存在于紫花苜蓿葉片揮發(fā)物中，與本試驗結果基本相符。王蕾等[15]采用動態(tài)頂空吸附收集法對5種豆科植物揮發(fā)物進行收集，鑒定結果中均有乙酸葉醇酯的存在，與本試驗結果一致。乙酸葉醇酯極可能為豆科植物中的一種特征組分，4-乙基苯甲醛是否為豆科植物的特征組分則有待進一步研究。

朱玉永[7]通過動態(tài)頂空吸附法收集蠶豆健康和受蚜蟲害植株的揮發(fā)性成分，鑒定出健康和蟲害后的22種揮發(fā)物主要有醛類、醇類和酯類等化合物；張靜靜等[16]采用固相微萃取法收集分析紫花苜蓿不同部位(莖、葉片、花)的揮發(fā)性成分，揮發(fā)物都以醇、酮、酯類化合物為主。本研究用這2種方法收集的3種豆科植物揮發(fā)物主要以醇類、醛類和酮類化合物為主，與二者的研究結果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，動態(tài)頂空吸附法收集的3種豆科植物揮發(fā)物以酮類為主，而固相微萃取法收集的酮類物質(zhì)含量卻相對較少，其揮發(fā)物主要為醇類物質(zhì)。魏明等[18]使用固相微萃取法萃取豇豆與菜豆的刺孔葉片，結果同樣以醇類物質(zhì)為主，這可能與固相微萃取法對不同揮發(fā)物的萃取能力及其萃取纖維頭的性質(zhì)有關，萃取纖維的極性和膜厚度決定了能夠萃取到的揮發(fā)物的種類[19]，本試驗中選用85 μm聚丙烯酸酯(PA)固相微萃取萃取頭，極性較大，因此萃取結果以醇類為主。要想全面了解植物揮發(fā)物的種類、組成和比例，還需要用多種萃取頭對目標植物進行分析。

植物揮發(fā)物的組成和含量的分析檢測會受到植物的生長條件、收集手段及檢測方法等多種因素的影響，其中不同的收集方法對不同揮發(fā)物的捕集效率不同，因而對檢測結果影響較大[20]。固相微萃取法幾乎克服了以往傳統(tǒng)樣品處理技術的所有缺點，集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體，不使用溶劑，避免了溶劑對樣品的污染；但是不同的萃取頭對所需平衡萃取時間、分析速度及分析結果存在差異[21]；且進樣前對植物進行剪切處理，機械損傷已然造成了植物揮發(fā)物成分的改變，并不能完全準確反映自然狀態(tài)下的植物揮發(fā)物組分，且一次采樣只能進行一次分析[22-23]。動態(tài)頂空吸附法具備活體植株取樣、操作便捷、對色譜柱的傷害較小等優(yōu)點[24]，但是該法使用有機溶劑洗脫環(huán)節(jié)增加了樣品污染的危險性，導致空白值增高，溶劑峰常常掩蓋保留時間短的痕量組分形成干擾[25]。為了更好地解析豆科植物揮發(fā)物成分并更準確地篩選對昆蟲具有引誘作用的活性組分，還需結合多種采集方法，并進行昆蟲對豆科寄主植物的電生理和生物行為試驗，以確定昆蟲識別豆科寄主植物的信號物質(zhì)。

4 結論

采用2種動態(tài)頂空吸附法和固相微萃取法(目前廣泛使用的收集方法)收集扁蓿豆、黑豆和野大豆3種豆科植物的揮發(fā)性成分，結合氣質(zhì)聯(lián)用技術對其進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，2種收集方法得到的組分有差異，但種類相似，初步確定3種豆科植物的揮發(fā)物主要以醇類、醛類和酮類為主，酸類和萜類化合物種類和相對含量極少；豆科植物重要特征組分為乙酸葉醇酯。動態(tài)頂空吸附法收集的揮發(fā)物以酯類為主，固相微萃取法的收集結果以醇類物質(zhì)為主。動態(tài)頂空吸附法能夠反映近自然狀態(tài)下植物揮發(fā)物的變化情況，適宜收集活體植株揮發(fā)性成分。