苗涵，王魯北，王振南，李富寬，王慧，楊燕，呂慎金

(1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.臨沂市城市管理綜合服務(wù)中心，山東 臨沂 276000；3.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 臨沂 276012)

土壤鹽漬化是我國面臨的主要環(huán)境問題[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國鹽土面積為1 600萬hm2(不包括濱海灘涂)，并呈不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)。因此，改良利用鹽堿地對(duì)于發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種在世界上廣泛種植的豆科牧草，較耐鹽堿，是改良鹽堿地的理想植物[2-3]。但當(dāng)鹽濃度過高時(shí)，苜蓿種子的發(fā)芽率及幼苗的成活率受到嚴(yán)重抑制[4-5]，嚴(yán)重阻礙了苜蓿草地的建植。目前，已有研究報(bào)道了鹽脅迫對(duì)苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[5-8]，所測(cè)發(fā)芽指標(biāo)以及幼苗生理指標(biāo)，如發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、脯氨酸含量、抗氧化酶活性等均能較好地揭示種子萌發(fā)及幼苗生長在鹽脅迫下的變化。如紫花苜蓿種子的發(fā)芽率隨鹽濃度的提高顯著下降[5]；鹽脅迫下紫花苜蓿品種的相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)隨著鹽濃度的升高呈降低趨勢(shì)[9]；鹽脅迫引起紫花苜蓿脯氨酸含量的增加[10]，但隨著鹽濃度的增加，其變化規(guī)律尚未進(jìn)一步探索。另外，植物的生長是一個(gè)連續(xù)的過程，種子萌發(fā)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)會(huì)進(jìn)一步影響幼苗的生長特性[11]。因此，本研究分析了不同濃度NaCl處理下，紫花苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗的生長隨鹽濃度增加的變化，并探討了其間的偶聯(lián)關(guān)系，以進(jìn)一步揭示紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿品種為阿爾岡金。種子由濟(jì)南市天橋區(qū)澳荷畜牧良種銷售中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

挑取飽滿的種子，采用0.1% KMnO4溶液消毒20 min，用清水沖洗干凈。用蒸餾水浸種12 h。采用直徑為10 cm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中均勻鋪放2層濕潤濾紙，每皿放入100粒種子。緩慢加入不同濃度(0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%)的NaCl溶液4 mL，0%濃度為對(duì)照。將培養(yǎng)皿放置在人工氣候箱中，溫度設(shè)置為25℃，光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)相關(guān)萌發(fā)指標(biāo)，并在第7 d稱取0.5 g全株(鮮重)，測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo) 以胚根長度為種子長度的2倍，胚芽與種子等長作為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)后計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率(Germination rate,GR,%)=(7 d時(shí)正常發(fā)芽的種子數(shù)/100)×100%

發(fā)芽勢(shì)(Germination potential,GP,%)=(4 d時(shí)正常發(fā)芽的種子數(shù)/100)×100%

發(fā)芽指數(shù)(Germination index,GI)=∑(Gt/Dt)

活力指數(shù)(Vigor index,VI)=GI×第7 d正常幼苗平均鮮重

式中，Dt為第t天，Gt為與Dt相應(yīng)的發(fā)芽種子數(shù)。

于第7 d隨機(jī)取10株苗，用直尺測(cè)量苗長度、根長度，以稱重法稱量苗鮮重、根鮮重。將稱量完鮮重的苗與根于65℃烘干24 h，稱量苗、根干重，計(jì)算全株鮮重和干重，進(jìn)而計(jì)算苗、根和全株植物的絕對(duì)含水量。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

全株鮮重(g)=苗鮮重+根鮮重

全株干重(g)=苗干重+根干重

苗(或根、全株)絕對(duì)含水量(%)=[1-苗(或根、全株)干重/苗(或根、全株)鮮重]×100%

1.3.2 生理指標(biāo)測(cè)定 對(duì)全株進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定。丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸氧化比色法測(cè)定[12]；可溶性糖(WSS)含量用蒽酮法測(cè)定[13]；脯氨酸(Proline)含量用磺基水楊酸法測(cè)定[14]；過氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[15]；過氧化氫酶(CAT)活性用過氧化氫-碘量法測(cè)定[16]；超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定[17]；可溶性蛋白(SP)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[18]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3次。采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及作圖，SPSS 17.0 One-Way ANOVA進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析，SPSS17.0構(gòu)建相關(guān)性模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

隨著NaCl濃度的升高，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(表1)。發(fā)芽率在高濃度(1.5%和1.8%)NaCl脅迫下顯著降低(P<0.05)，低濃度脅迫下不顯著(P>0.05)。但NaCl脅迫均顯著延緩了種子的發(fā)芽速度，并且隨著NaCl濃度的增加，種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均呈顯著降低的趨勢(shì)。說明NaCl脅迫對(duì)種子的萌發(fā)有抑制作用。

表1 不同濃度NaCl處理下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)

2.2 NaCl脅迫對(duì)苗高、根長和全株長的影響

隨著鹽濃度的增加，紫花苜蓿苗高、根長和全株長先增加后降低。NaCl濃度為0.3%時(shí)，苗高、根長和全株長顯著增加(P<0.05)，高濃度NaCl(1.5%，1.8%)脅迫顯著降低了苗高、根長和全株長(P<0.05)。其他濃度間無顯著變化(P>0.05)(表2)。

表2 不同濃度NaCl處理下的苗高、根長和全株長

2.3 NaCl脅迫對(duì)幼苗鮮重、干重及絕對(duì)含水量的影響

NaCl脅迫對(duì)紫花苜蓿鮮重、干重及絕對(duì)含水量影響顯著(P<0.05)(表3)。隨著NaCl濃度的增加，苗鮮重、全株鮮重、苗干重、全株干重呈先增加后降低的趨勢(shì)，在0.9%濃度時(shí)達(dá)到最大值；但根鮮重呈顯著降低的趨勢(shì)；根干重只在高濃度下(1.5%和1.8%)顯著降低(P<0.05)；苗和全株絕對(duì)含水量呈先增加后降低的趨勢(shì)，1.2%濃度時(shí)達(dá)到最大值；但根絕對(duì)含水量呈降低趨勢(shì)。NaCl脅迫顯著降低了紫花苜蓿的根冠比(P<0.05)。

表3 不同濃度NaCl處理下的幼苗鮮重、干重、絕對(duì)含水量

2.4 NaCl脅迫對(duì)紫花苜蓿生理指標(biāo)的影響

隨著NaCl濃度增加，苜蓿MDA含量呈先增加后降低的趨勢(shì)(NaCl濃度為0.3%時(shí)除外)，濃度為0.6%時(shí)最高。POD活性在NaCl為0.6%和1.5%時(shí)，顯著低于其他NaCl濃度(P<0.05)。SOD活性在高濃度(1.2%、1.5%和1.8%)NaCl脅迫下顯著高于低濃度脅迫(P<0.05)。CAT活性隨NaCl濃度增加呈先增加后降低的趨勢(shì)(0.3%和1.5% NaCl濃度除外)。脯氨酸含量在NaCl為0%、1.5%和1.8%時(shí)顯著高于其他濃度(P<0.05)。隨著NaCl濃度的增加，WSS含量顯著降低，SP含量顯著增加(P<0.05)，但0.9%濃度時(shí)不顯著(表4)。

表4 不同濃度NaCl處理下紫花苜蓿幼苗的生理特征

2.5 紫花苜蓿幼苗生長性狀、生理特征與種子萌發(fā)的關(guān)系

紫花苜蓿幼苗苗長、根長、全株長、根鮮重、根干重、根絕對(duì)含水量與種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)基本呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)(表5)。

表5 紫花苜蓿幼苗生長性狀與種子萌發(fā)的關(guān)系

3種抗氧化酶中，只有SOD酶活性與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。脯氨酸含量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與種子活力指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)?？扇苄蕴呛颗c發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。可溶性蛋白含量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(表6)。

表6 紫花苜蓿幼苗生理特征與種子萌發(fā)的關(guān)系

3 討論

土壤鹽漬化是我國面臨的主要環(huán)境問題，其嚴(yán)重限制了植物的萌發(fā)與生長。紫花苜蓿較耐鹽堿，是改良鹽堿地的理想植物。但隨著鹽濃度的升高，對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)越顯著[19]，這在本研究也得到了相似的結(jié)果。但也有研究表明，NaCl濃度過高時(shí)才抑制苜蓿種子的萌發(fā)，而低濃度的NaCl處理能促進(jìn)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)等[19-21]。另外，高濃度的NaCl脅迫抑制了苜蓿幼苗的長度及質(zhì)量，但低濃度的NaCl脅迫因苜蓿品種的不同或抑制或促進(jìn)[22]。在本研究中，低濃度NaCl處理誘導(dǎo)了苗高、根長和全株長的增加，促進(jìn)了幼苗和全株鮮重、干重和絕對(duì)含水量的增加，但抑制了根干重和鮮重的積累，且幼苗根冠比隨NaCl濃度的增加顯著降低，說明NaCl脅迫對(duì)根系抑制效應(yīng)更顯著。本研究表明，紫花苜蓿種子的萌發(fā)情況與幼苗根系的長度、重量及絕對(duì)含水量呈顯著正相關(guān)，而與苗和全株的重量、絕對(duì)含水量關(guān)系基本不顯著，這更加說明NaCl脅迫對(duì)紫花苜蓿根生長的抑制作用更顯著。

紫花苜蓿發(fā)芽過程中受NaCl脅迫，其內(nèi)部生理生化特性亦發(fā)生異常。一般情況下，NaCl脅迫打破了植物體內(nèi)活性氧的代謝平衡，從而使膜脂過氧化物的最終分解產(chǎn)物丙二醛隨NaCl濃度的增加呈顯著增加的趨勢(shì)[23]。但本研究中，MDA呈先增加后降低的趨勢(shì)，這可能是由于高NaCl濃度抑制了弱勢(shì)苜蓿種子的發(fā)芽，使剩余發(fā)芽的種子具有較高的抗鹽性。這在本研究中得到了一定的證實(shí)，即保護(hù)性物質(zhì)SOD的活性、脯氨酸含量和可溶性蛋白含量與種子萌發(fā)指標(biāo)呈顯著的負(fù)相關(guān)。

4 結(jié)論

(1) 隨著NaCl濃度的增加，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈降低的趨勢(shì)。

(2) NaCl脅迫影響了紫花苜蓿幼苗的形態(tài)特征，相比于苗和全株，對(duì)根生長的抑制作用更顯著。