于曉麗，陳超妍，吳雪寧，時(shí)云龍，劉 超，劉振寧

（臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 256000）

植物ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又稱ATP 結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC transporters），其廣泛存在于真核生物和原核生物中，是目前已知功能多樣、種類繁多的蛋白家族［1］。其中ABCB 蛋白為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個亞家族，又稱為多藥物抗性蛋白（Multidrug Resistance，MDR）或p-糖蛋白（p-glycoprotein，PGP）。在植物中研究發(fā)現(xiàn)，ABCB/PGP 蛋白家族主要參與生長素的極性運(yùn)輸［2］。另有研究表明，ABCB/PGP蛋白參與了植物細(xì)胞的木質(zhì)化進(jìn)程以及鐵的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡［3-4］。目前，研究人員已經(jīng)對擬南芥、水稻、玉米、高粱、楊樹、桃、卷柏和小立碗蘚等植物中的ABCB/PGP 基因家族進(jìn)行了全基因組水平上的鑒定與分析。大白菜是我國的特色蔬菜之一，栽培面積和消費(fèi)量在我國各類蔬菜中排行前列。大白菜全基因組測序的完成使得對大白菜相關(guān)基因家族的鑒定與分析成為可能。

本研究利用擬南芥ABCB/PGP 氨基酸序列作為種子序列在大白菜基因組中進(jìn)行搜索比對，鑒定出大白菜中ABCB/PGP 基因家族成員，并結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析ABCB/PGP 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分類，以期為進(jìn)一步研究大白菜ABCB/PGP 基因的生物學(xué)功能奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大白菜ABCB/PGP 基因家族的鑒定

以擬南芥ABCB/PGP 蛋白的氨基酸序列作為種子序列在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫（http://brassicadb.org/brad/）中通過BLAST P 進(jìn)行第一次比對搜索，找出候選基因。為了防止候選基因存在遺漏，再在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了二次BLAST P 比對搜索，保證最后數(shù)據(jù)的完整性。最后，利用Pfam 數(shù)據(jù)庫、SMART 數(shù)據(jù)庫和NCBI 的保守域數(shù)據(jù)庫分析候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的有無鑒定是否屬于該基因家族。

1.2 大白菜ABCB/PGP 基因的基因組信息和染色體定位

通過大白菜基因組數(shù)據(jù)庫獲得大白菜ABCB/PGP 基因的序列和基因組信息，并根據(jù)每一個ABCB/PGP 基因在染色體上的精確位置和染色體的長度使用Photoshop 軟件將ABCB/PGP 基因人工定位到對應(yīng)的染色體上。大白菜ABCB/PGP 蛋白的分子量和等電點(diǎn)通過進(jìn)行在線分析。

1.3 大白菜ABCB/PGP 基因的結(jié)構(gòu)分析、保守域分析和進(jìn)化樹分析

ABCB/PGP 基因的外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)圖使用GSDS 在線軟件繪制。關(guān)于進(jìn)化樹的構(gòu)建，使用MEGA 5.0軟件自帶的Clustal W 應(yīng)用對蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，空格罰分設(shè)置為10，空格擴(kuò)展罰分設(shè)置為0.2。然后將比對好的序列利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)化樹使用鄰接法構(gòu)建，采用泊松校正，成對刪除和1 000次重復(fù)等建樹參數(shù)然后將比對好的序列構(gòu)成進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜ABCB/PGP 基因家族的鑒定和注釋

根據(jù)擬南芥ABCB/PGP 蛋白的氨基酸序列，在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫中搜索比對，在大白菜中鑒定到31 個ABCB/PGP 蛋白，同時(shí)參考擬南芥ABCB/PGP 基因命名的方法對大白菜ABCB/PGP 基因進(jìn)行了命名，見表1。31個ABCB/PGP 基因的開放閱讀框長度在442～4 249 bp，編碼147～1 416 個氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量在24.6～332.1 kDa，等 電 點(diǎn) 在4.76～9.48。大 部 分ABCB/PGP 基因都定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。對大白菜ABCB/PGP 基因染色體定位的分析表明，ABCB/PGP 基因在大白菜的10 條染色體上分布不是很均勻，其中第3、4、6、7 和9 號染色體上較多，而第1、2、5、8 和10 號染色體上的ABCB/PGP 基因則比較少，僅有一兩個分布其上，如圖1 所示。

表1 大白菜ABCB/PGP 基因家族成員基因組信息和蛋白特征分析

2.2 大白菜ABCB/PGP 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類

為分析大白菜ABCB/PGP 基因的系統(tǒng)發(fā)育和分類，選取了大白菜、擬南芥這兩個代表性物種中ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列，使用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建了NJ 進(jìn)化樹并對ABCB/PGP 基因進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果表明，這2 個物種中的52 個ABCB/PGP 基因被聚類成6 個分支，分支為Clade Ⅰ、Clade Ⅱ、Clade Ⅲ、Clade Ⅳ、Clade Ⅴ和Clade Ⅵ。從進(jìn)化樹中可以看出每個分支都含有擬南芥ABCB/PGP 基因與大白菜ABCB/PGP基因，分布比較均勻。其中CladeⅠ分支是基因分布最多的，在Clade Ⅰ分支中含有9 個大白菜ABCB/PGP 基因，分別為BrABCB1～BrABCB9，而擬南芥ABCB/PGP 基因含有8 個，分別為AtPGP3、AtPGP4、AtPGP5、AtPGP7、AtPGP9、AtPGP11、AtPGP12、AtPGP21；分 支Clade Ⅴ是分布最少的，其中大白菜ABCB/PGP 基因含有2 個，為BrABCB25 和BrABCB26，擬南芥ABCB/PGP 基因也含有2 個，分別為AtPGP13 和AtPGP14。其他的Clade Ⅱ分支含有大白菜ABCB/PGP 基因9 個，含有擬南芥ABCB/PGP基因4 個；Clade Ⅲ分支含有大白菜ABCB/PGP 基因3 個，而含有擬南芥ABCB/PGP 基因2 個；Clade Ⅳ分支中含有大白菜ABCB/PGP 基因4 個，擬南芥ABCB/PGP 基因2個；Clade Ⅵ分支含有大白菜ABCB/PGP 基因5 個，擬南芥ABCB/PGP 基因也是2 個。

為進(jìn)一步研究大白菜ABCB/PGP 基因在植物中的進(jìn)化模式，選用了大白菜、擬南芥、水稻、玉米、楊樹、小立碗蘚、卷柏和桃這8 個代表性物種中的ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列使用MEGA5.0 軟件構(gòu)建了進(jìn)化樹并對各物種中ABCB/PGP 基因進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，這8 個物種的ABCB/PGP 基因被聚類成7 個分支，多了一個分支Clade Ⅶ。其中Clade Ⅰ～Ⅵ每個分支都有分布各個物種的基因，而Clade Ⅶ分支上沒有大白菜和擬南芥的基因分布。

圖1 大白菜ABCB/PGP 基因染色體定位

圖2 大白菜和擬南芥ABCB/PGP 基因的進(jìn)化樹

2.3 大白菜ABCB/PGP 基因的基因結(jié)構(gòu)分析

為研究大白菜ABCB/PGP 基因的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)大白菜基因組信息獲取了每一個ABCB/PGP 基因的DNA和CDS 序列信息并構(gòu)建了其基因結(jié)構(gòu)圖（圖4），結(jié)果表明大部分ABCB/PGP 基因都有4～13 個不等的外顯子且各分支分布相對比較均勻，只有其中部分小分支如BrABCB24、BrABCB31 分布較少只有1～2 個。同時(shí)，大部分ABCB/PGP 基因都含有3～12 個不等的內(nèi)含子，其中BrABCB24 有1 個內(nèi)含子，而BrABCB31 則沒有內(nèi)含子。

圖3 陸生植物8 個物種中ABCB/PGP 基因的進(jìn)化樹

圖4 大白菜ABCB/PGP 的基因結(jié)構(gòu)圖

3 討論與結(jié)論

本研究在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定到了31 個ABCB/PGP 基因家族成員，該家族是一個成員數(shù)目相對較多的家族。Gao 等通過大白菜基因組數(shù)據(jù)庫對生長素運(yùn)輸相關(guān)的3 個蛋白家族成員（AUX/LAX、PIN 和ABCB/MDR/PGP）進(jìn)行了鑒定，其中篩選到27 個ABCB/PGP 基因家族成員，比本研究中鑒定到的基因家族成員少4個，分別為Bra025328、Bra039056、Bra027825和Bra033064［5］。但是需要注意的是，Bra027825 和Bra033064 這兩個基因的開放閱讀框長度跟其他ABCB/PGP 基因家族成員相比較小，筆者推測這兩個基因可能是假基因或者沒有拼接出全長序列。

本研究首先選取了大白菜和擬南芥2 個物種的ABCB/PGP 蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，52個ABCB/PGP基因被聚類成6個分支，即CladeⅠ～CladeⅥ，然后進(jìn)一步選取了大白菜、擬南芥、水稻、玉米、楊樹、小立碗蘚、卷柏和桃8 個代表性物種中的ABCB/PGP 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)這8 個物種的ABCB/PGP 基因被聚類成7 個分支，多了一個分支Clade Ⅶ，而Clade Ⅶ分支上均沒有大白菜和擬南芥的基因分布。大白菜ABCB/PGP 基因在Clade Ⅶ的缺失原因仍有待進(jìn)一步研究。