羅佳年華，董玉蓉，張珊珊，張小濛，趙林果*

(1.南京林業(yè)大學(xué)江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210037)

紫杉醇(Paclitaxel)是一種三環(huán)二萜類化合物，最早從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)的樹皮中提取獲得[1]。紫杉醇對(duì)多種癌癥具有顯著的抑制作用[2-5]，此外，還對(duì)中風(fēng)、老年癡呆等具有很好的療效[6]。紫杉醇在臨床上的需求極大，但其在紅豆杉屬植物中的含量極低(僅為0.005%～0.015%)。迄今為止，紫杉醇的制備方法包括傳統(tǒng)的提取法、化學(xué)合成法、內(nèi)生菌培養(yǎng)法和植物細(xì)胞培養(yǎng)法[7]等。然而，傳統(tǒng)提取法費(fèi)時(shí)費(fèi)力；化學(xué)合成法路線復(fù)雜，且合成得率低，不適合工業(yè)生產(chǎn)；內(nèi)生菌培養(yǎng)法無法達(dá)到工業(yè)產(chǎn)量需求；植物細(xì)胞培養(yǎng)法存在植物細(xì)胞易變異、紫杉醇表達(dá)水平低且產(chǎn)量不穩(wěn)定等問題[8]。

7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-XDT)主要存在于樹葉中，其含量遠(yuǎn)高于紫杉醇和其他紫杉烷類化合物，是紫杉醇含量的20～50倍[9]。因此，提取含量較高的7-XDT，并將其轉(zhuǎn)化為紫杉醇，是一種有效利用植物資源的可持續(xù)途徑[10]。迄今為止，有關(guān)β-木糖苷酶應(yīng)用于轉(zhuǎn)化7-XDT制備10-去乙?；仙即?10-DT) 的報(bào)道甚少。Cheng等[11]利用糖苷水解酶Lxyl-p1-2轉(zhuǎn)化7-β-木糖基紫杉烷；Dou等[12]利用新型的類纖維素多酶復(fù)合物，其能對(duì)7-木糖基-10-去乙?；仙即歼M(jìn)行高效糖苷水解。而應(yīng)用于轉(zhuǎn)化7-XDT制備10-DT的嗜熱菌來源的β-木糖苷酶資源匱乏，僅Li等[13]報(bào)道了有關(guān)嗜熱菌來源的且能用于7-XDT制備10-DT的β-木糖苷酶。

目前已報(bào)道的β-木糖苷酶多為低溫、中溫酶，其熱穩(wěn)定性普遍不高。然而，工業(yè)生產(chǎn)中常需要較高的反應(yīng)溫度來增加底物溶解度、降低污染風(fēng)險(xiǎn)、提高傳質(zhì)速率等。因此，從嗜熱菌中篩選熱穩(wěn)定性強(qiáng)的β-木糖苷酶已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。β-木糖苷酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)時(shí)常會(huì)伴隨著包涵體過多的現(xiàn)象，尤其是來源于嗜熱菌的β-木糖苷酶，因其自身含有較多的二硫鍵，表達(dá)后若不能及時(shí)正確地折疊，更易形成包涵體，這將極大地影響目的蛋白的有效產(chǎn)量，并限制嗜熱菌來源的β-木糖苷酶在大規(guī)模水解7-XDT中的應(yīng)用。分子伴侶能夠幫助異源表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行正確折疊，提高蛋白的可溶性表達(dá)，減少包涵體的形成[14]。因此，利用分子伴侶蛋白質(zhì)粒(如pKJE6[15]、pTf16[16]等)與目的基因質(zhì)粒共表達(dá)，是提高重組目的蛋白可溶性表達(dá)的一種有效手段。

以嗜熱菌ThermotogapetrophilaDSM 13995來源的β-木糖苷酶Tpexyl3為研究對(duì)象，借助分子伴侶共表達(dá)、培養(yǎng)條件優(yōu)化等方法，提高了該酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量，在此基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)化7-XDT制備10-DT，并對(duì)該反應(yīng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

β-木糖苷酶基因Tpexyl3(序列數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)：ABQ46867.1)來源于嗜熱菌T.petrophila，重組質(zhì)粒pET-28a-Tpexyl3由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保藏；分子伴侶質(zhì)粒(pKJE6、pKJE7、pG-KJE8、pG-Tf2、pTf16和pGro7)，購自日本TaKaRa公司；EscherichiacoliDH5α及E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

酵母提取物、蛋白胨，美國(guó)Oxoid公司；麥芽糊精，市售；蛋白含量檢測(cè)試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；對(duì)硝基苯酚木糖苷(pNPX)、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250，美國(guó)Sigma公司；蛋白電泳緩沖液、預(yù)混蛋白電泳Marker，南京天為公司；卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、L-阿拉伯糖，生物工程(上海)生物科技有限責(zé)任公司。

1.3 培養(yǎng)基

溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%蛋白胨、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%酵母提取物、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%氯化鈉。富集肉湯(TB)培養(yǎng)基：A液(體積分?jǐn)?shù)90%)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%麥芽糊精(或其他碳源)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%蛋白胨、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.4%酵母提取物；B液(體積分?jǐn)?shù)10%)為磷酸二氫鉀17 mmol/L和磷酸氫二鉀72 mmol/L。

1.4 主要儀器與設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀(HPLC)及S.No. USNH017518型C18 反向色譜柱(直徑和長(zhǎng)分別為4.6和250 mm，填料顆粒直徑5 μm)，美國(guó)安捷倫科技有限公司；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；ZHWY-2102C搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；SpectraMax190型酶標(biāo)儀，美國(guó)分子儀器公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司；電泳儀，美國(guó)GE Health公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分子伴侶蛋白的篩選

6種分子伴侶質(zhì)粒(pKJE6、pKJE7、pG-KJE8、pG-Tf2、pTf16、pGro7)的主要信息見表1。分別將6種分子伴侶質(zhì)粒與重組β-木糖苷酶質(zhì)粒pET-28a-Tpexyl3混合后熱擊轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用含有50 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氯霉素抗性的LB平板進(jìn)行篩選，37 ℃過夜培養(yǎng)。分別挑取6種共表達(dá)陽性轉(zhuǎn)化子于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)，分別保存菌種。

表1 分子伴侶質(zhì)粒Table 1 Molecular chaperone plasmid

菌種復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)接入含有50 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氯霉素的50 mL LB培養(yǎng)基中，添加0.5 mg/mLL-阿拉伯糖以及(或者)10 μg/mL四環(huán)素，于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至600 nm下的吸光度(OD600)至 0.6～0.8，加入0.01 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)7 h。收集菌液，10 000 r/min 離心10 min后收集菌體；再各用10 mL的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎后取樣為全細(xì)胞樣品；12 000 r/min離心10 min后收集上清液。分別測(cè)定各上清液酶活并進(jìn)行酶活和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，篩選出能提高目的蛋白表達(dá)的分子伴侶。

1.5.2 培養(yǎng)條件對(duì)重組菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響

將篩選的共表達(dá)菌種接種至5 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床過夜培養(yǎng)復(fù)蘇菌種。

TB培養(yǎng)基碳源種類優(yōu)化：分別接種復(fù)蘇菌液500 μL至50 mL含有不同碳源(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%麥芽糊精、1%甘油、1%蔗糖、1%葡萄糖和1%菊粉)的5瓶TB培養(yǎng)基(均含有50 μg/mL卡那霉素、20 μg/mL氯霉素和0.5 mg/mLL-阿拉伯糖)中，保持其他培養(yǎng)條件一致，當(dāng)OD600約為 0.6時(shí)，加入0.01 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于37 ℃搖床培養(yǎng)48 h。10 000 r/min離心分別收集菌體、重懸菌體、超聲破碎，破碎懸浮液取樣為全細(xì)胞樣品，12 000 r/min離心收集上清液。分別測(cè)定各上清液酶活并進(jìn)行比較，篩選出TB培養(yǎng)基最佳碳源種類。

分別對(duì)TB培養(yǎng)基碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.25%，0.50%，1.00%，2.00%，3.00%和4.00%)、IPTG濃度(0，0.01，0.02，0.05，0.10和0.20 mmol/L)、L-阿拉伯糖質(zhì)量濃度(0，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mg/mL)以及誘導(dǎo)溫度(20，25，28，32，37和42 ℃)進(jìn)行優(yōu)化。重組菌的培養(yǎng)和酶活測(cè)定方法同上。

1.5.3 酶活力的測(cè)定

以20 mmol/LpNPX為底物，水解得到的對(duì)硝基苯酚(pNP)與碳酸鈉發(fā)生顯色反應(yīng)，在405 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物的吸光度。反應(yīng)體系為：10 μL 500 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，5 μL底物，混勻預(yù)熱后加入5 μL游離酶，在酶的最適溫度和pH下反應(yīng)5 min。以不加酶液的反應(yīng)體系作空白對(duì)照，酶活力單位定義參照文獻(xiàn)[17]，酶活計(jì)算公式如下：

β-木糖苷酶酶活 (U/mL) =c/(t×V)×N

(1)

式中：c為酶反應(yīng)后的對(duì)硝基苯含量，μmol；t為酶與底物反應(yīng)時(shí)間，min；V為反應(yīng)體系中酶液的體積，mL；N為酶液的稀釋倍數(shù)。

1.5.4 重組蛋白的純化

將粗酶液于55 ℃下保溫30 min，12 000 r/min離心30 min，收取上清液為熱處理后酶液。將熱處理后酶液上樣至Ni+親和層析柱，使用含有不同濃度咪唑(30，100，200 和400 mmol/L)的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，并收集洗脫液。使用SDS-PAGE對(duì)純化的酶液進(jìn)行分析，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.5.5 反應(yīng)條件對(duì)重組酶轉(zhuǎn)化底物的影響

向200 μL的25 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖反應(yīng)體系中加入終質(zhì)量濃度為500 mg/L 的7-XDT和不同添加量的Tpexyl3，在一定溫度下反應(yīng)3 h后加入200 μL 甲醇終止反應(yīng)，樣品過膜后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。改變緩沖溶液的pH(4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0)、溫度(60，70，80，90和99 ℃)以及酶用量(10，25，50，75，100，250和500 U/mL)，從而考察pH、溫度和酶用量對(duì)Tpexyl3水解7-XDT的影響。

Tpexyl3水解7-XDT的時(shí)間反應(yīng)歷程檢測(cè)：Tpexyl3水解7-XDT于90 ℃下反應(yīng)12 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣加入200 μL甲醇，樣品過膜后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子伴侶蛋白的篩選

將重組質(zhì)粒pET-28a-Tpexyl3分別與6種分子伴侶質(zhì)粒等體積混合后，共同轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)表達(dá)宿主中，獲得6種共表達(dá)菌株：pET-28a-Tpexyl3-pKJE6、pET-28a-Tpexyl3-pKJE7、pET-28a-Tpexyl3-pG-KJE8、pET-28a-Tpexyl3-pGro7、pET-28a-Tpexyl3-pG-Tf2和pET-28a-Tpexyl3-pTf16。培養(yǎng)后收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE對(duì)目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。其中，質(zhì)粒pKJE6、pKJE7、pG-KJE8和pGro7分別與pET-28a-Tpexyl3共表達(dá)時(shí)，包涵體沉淀較pET-28a-Tpexyl3單獨(dú)表達(dá)時(shí)明顯減少。

1)Tpexyl3全細(xì)胞；2)Tpexyl3上清液；3)pET-Tpexyl3-pG-KJE8全細(xì)胞；4)pET-Tpexyl3-pG-KJE8上清液；5)pET-Tpexyl3-pG-Tf2全細(xì)胞；6)pET-Tpexyl3-pG-Tf2上清液；7)pET-Tpexyl3-pTf16全細(xì)胞；8)pET-Tpexyl3-pTf16上清液；9)pET-Tpexyl3-pGro7全細(xì)胞；10)pET-Tpexyl3-pGro7上清液；M)蛋白Marker；11)pET-Tpexyl3-pKJE6全細(xì)胞；12)pET-Tpexyl3-pKJE6上清液；13)pET-Tpexyl3-pKJE7全細(xì)胞；14)pET-Tpexyl3-pKJE7上清液。圖1 分子伴侶篩選的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of chaperones screening

分別測(cè)定各自上清液的酶活并進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示，pET-28a-Tpexyl3-pKJE7的酶活明顯高于其他共表達(dá)菌株，這表明當(dāng)分子伴侶蛋白質(zhì)粒pKJE7與重組質(zhì)粒pET-28a-Tpexyl3共表達(dá)時(shí)能顯著減少包涵體含量，提高目的蛋白的有效表達(dá)。因此，選取pET-28a-Tpexyl3-pKJE7進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 分子伴侶種類篩選酶活測(cè)定Fig. 2 Chaperones screening and enzyme activities

2.2 Tpexyl3與分子伴侶共表達(dá)的條件優(yōu)化

為進(jìn)一步獲得目的蛋白的高效表達(dá)，使用TB培養(yǎng)基對(duì)pET-28a-Tpexyl3-pKJE7進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，結(jié)果見圖3。由圖3可以得知，pET-28a-Tpexyl3-pKJE7表達(dá)目的蛋白的最優(yōu)條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00% 的麥芽糊精作為TB培養(yǎng)基的碳源，不添加誘導(dǎo)劑，于32 ℃搖床培養(yǎng)48 h，最高表達(dá)量可至190 U/mL，是無分子伴侶參與下LB培養(yǎng)基中表達(dá)量(6.81 U/mL)的27.9倍，且高于其在7.5 L發(fā)酵罐中連續(xù)發(fā)酵10 h后的表達(dá)量(151.43 U/mL)。目的蛋白Tpexyl3在不添加誘導(dǎo)劑時(shí)即可達(dá)到高效表達(dá)。這可能是由于在培養(yǎng)基中微量的乳糖已足夠啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄，其本底表達(dá)即可獲得極高的表達(dá)量，即使微量的IPTG都會(huì)降低目的蛋白的表達(dá)量，這在實(shí)際應(yīng)用中更具有應(yīng)用前景。

圖3 重組酶Tpexyl3的表達(dá)條件優(yōu)化Fig. 3 Optimization of expression conditions and purification of recombinant Tpexyl3

2.3 Tpexyl3的純化及酶活性測(cè)定

誘導(dǎo)后的pET-28a-Tpexyl3-pKJE7，經(jīng)超聲破碎、熱處理和親和層析純化后獲得了電泳純的目的蛋白，純化過程及結(jié)果如表2所示。由表2可知，pET-28a-Tpexyl3-pKJE7的比酶活為205.76 U/mg，得率為6.57%，純化倍數(shù)為2.46倍。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果如圖4所示，在87 ku(預(yù)測(cè)目的蛋白理論大小)左右，有單一條帶，純化獲得電泳純重組酶Tpexyl3。

表2 重組酶Tpexyl3的純化Table 2 Purification of recombinant Tpexyl3

獲得純化酶后，對(duì)Tpexyl3的最適反應(yīng)溫度與最適反應(yīng)pH再次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，Tpexyl3的最適反應(yīng)溫度為90 ℃，最適反應(yīng)pH為6.0，結(jié)果與Zhang等[18]測(cè)定結(jié)果一致。可見與分子伴侶共表達(dá)時(shí)，Tpexyl3的基本性質(zhì)未受影響，目的蛋白正確折疊。

C為粗酶液；H為熱處理；1～4為咪唑洗脫液(30, 100, 200和400 mmol/L)；M為蛋白Marker。圖4 重組酶Tpexyl3 SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE of recombinant enzyme Tpexyl3

2.4 Tpexyl3轉(zhuǎn)化7-XDT的反應(yīng)條件優(yōu)化

7-XDT與紫杉醇具有相同的母核結(jié)構(gòu)(圖5)，對(duì)7-XDT的C-7位去木糖基化，是以7-XDT為底物酶法制備紫杉醇過程中的關(guān)鍵步驟。為了獲得Tpexyl3水解7-XDT的最適pH、最適溫度、最適反應(yīng)時(shí)間及最適用酶量，以滅活的Tpexyl3 處理7-XDT的含量為對(duì)照，結(jié)果如圖6所示。在pH 5.5、80 ℃溫度下，添加250 U/mL Tpexyl3反應(yīng)4 h，可將500 mg/L 7-XDT轉(zhuǎn)化為162 mg/L 10-DT，物質(zhì)的量轉(zhuǎn)化率可至45.59%。

圖5 酶法轉(zhuǎn)化7-XDT生成紫杉醇流程圖Fig. 5 Biotransformation of 7-XDT into taxol

參考Tpexyl3的熱穩(wěn)定性，4 h反應(yīng)后體系中應(yīng)仍有殘余酶存在。因此，為最大限度發(fā)揮添加酶的利用度及檢測(cè)反應(yīng)過程中各組分的變化，通過分時(shí)段取樣，研究了延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至12 h的整體反應(yīng)歷程，結(jié)果如圖6d所示。在整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中，7-XDT含量逐漸降低，10-DT含量逐漸增高，2 h內(nèi)產(chǎn)物量達(dá)到最高，2 h后反應(yīng)體系各組分保持不變。底物未能完全轉(zhuǎn)化，這可能與反應(yīng)體系中的產(chǎn)物抑制相關(guān)。

圖6 重組酶Tpexyl3轉(zhuǎn)化7-XDT生成10-DT反應(yīng)條件優(yōu)化Fig. 6 Optimization of reaction conditions for the transformation of 7-XDT to 10-DT by recombinant enzyme Tpexyl3

3 結(jié) 論

1)將分子伴侶蛋白質(zhì)粒與目的蛋白質(zhì)粒在大腸桿菌中共表達(dá)，經(jīng)篩選后發(fā)現(xiàn)伴侶蛋白dnaK-dnaJ-grpE能成功幫助嗜熱菌T.petrophilaDSM 13995來源的β-木糖苷酶Tpexyl3正確折疊，提高目的蛋白可溶性表達(dá)量。經(jīng)優(yōu)化，Tpexyl3的表達(dá)量最高可達(dá)190 U/mL。研究結(jié)果為提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的可溶性表達(dá)，提供了一種較為可行的方法。

2)Tpexyl3能有效轉(zhuǎn)化7-XDT生成10-DT，在pH 5.5、80 ℃、酶用量 250 U/mL等適宜條件下反應(yīng)4 h，可將500 mg/L 7-XDT轉(zhuǎn)化為162 mg/L 10-DT，物質(zhì)的量轉(zhuǎn)化率為45.59%。下一步將通過酶的定向改造、催化轉(zhuǎn)化體系等方法進(jìn)一步優(yōu)化，提高7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DT的效率，為以7-XDT為底物制備紫杉醇的技術(shù)創(chuàng)新提供支撐。