張 靜，李建東

(1.中國人民解放軍陸軍第八十一集團軍醫(yī)院麻醉科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院基礎醫(yī)學院生理教研室，河北 張家口 075000)

利多卡因是一種氨基酰胺型局部麻醉劑，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗痛覺過敏的作用，但其對心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定毒性，可導致脊髓神經(jīng)元細胞凋亡[1]、神經(jīng)毒副反應[2]，對心臟的毒性表現(xiàn)為心動過緩、房室或室內(nèi)傳導阻滯和室性心律失常，導致循環(huán)衰竭，甚至出現(xiàn)心臟驟停[3]。經(jīng)皮穴位電刺激(transcutaneous electrical acupoint stimulation，TAES)是一種將經(jīng)皮電刺激與穴位療法相結(jié)合用于針灸實踐改進的治療方法，入侵性低、安全且技術(shù)簡單。TEAS具有鎮(zhèn)痛作用，可以促進麻醉效果，并減少麻醉藥物用藥劑量[4-5]。方劍喬[6]等研究發(fā)現(xiàn)，TAES能改善心肌缺血狀況和心功能恢復能力，減少心肌細胞凋亡，從而對心肌起到保護作用。我們以大鼠為研究對象，分析不同TEAS處理時間對利多卡因致大鼠心臟毒性的影響，探討TEAS對局麻藥中毒心臟保護的可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g，隨機分為5組各10只：空白組、模型組、TEAS Ⅰ組、TEAS Ⅱ組、TEAS Ⅲ組。

1.2 實驗儀器與試劑

LDH酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、CK-MB酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、T-SOD活力檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒、NO含量檢測試劑盒和NOS活性測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，鹽酸利多卡因注射液(上海朝暉藥業(yè)有限公司，H31021072)；鈣離子熒光探針Fluo-3AM(碧云天)，LH202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，SpectraMax M4酶標儀。

1.3 方法

用經(jīng)皮電刺激儀持續(xù)做經(jīng)皮穴位電刺激，穴位選用雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”“合谷”“足三里”“三陰交”，同側(cè)穴位連接電極，刺激強度6～8 mA，頻率5 Hz，TEAS Ⅰ組刺激20 min，TEAS Ⅱ組刺激40 min，TEAS Ⅲ組刺激60 min。電刺激后，大鼠在腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg·kg-1麻醉下，仰臥位固定于動物臺上，用3根針灸針插入大鼠雙前肢及左后肢皮下，監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)ECG。暴露左側(cè)股靜脈，置入24 G套管針，用于利多卡因給藥；暴露右側(cè)頸動脈，置入24 G套管針用于監(jiān)測動脈血壓?？瞻捉M泵注生理鹽水，其余4組大鼠股靜脈勻速泵注0.75%利多卡因2 mg·(kg·min)-1。所有大鼠持續(xù)泵注6 min后開腹，分離出腹主動脈，通過腹主動脈采血保存待測。在取血后迅速結(jié)扎主動脈干，并沿結(jié)扎處心臟一側(cè)將心臟剪開，分離出左心室迅速置于-80 ℃冰箱冷藏。

稱取冷凍的心臟組織，按質(zhì)量(g)∶容積(mL)=1/9的比例加入生理鹽水制成10%的勻漿液，以3 500 rpm離心10min，上清液即為10%組織勻漿，用前用生理鹽水按1/9的比例稀釋成1%勻漿液。

將心肌細胞以10 000個細胞/皿的密度接種在35 mm共聚焦培養(yǎng)皿中。每次處理后，用PBS洗滌細胞三次，然后在37 ℃下用10 μmol·L-1Fluo-3/AM((Fluo-3/AM∶激發(fā)/發(fā)射=488/525 nm)孵育30 min。然后棄去溶液，PBS完全洗掉細胞外無負載的游離Fluo-3/AM，共聚焦激光掃描顯微鏡掃描圖像，測量熒光強度以測定心肌細胞Ca2+含量。

持續(xù)監(jiān)測MAP和HR變化，嚴格按照試劑盒說明書測定泵注利多卡因6 min后心肌組織乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性、Ca2+含量的變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 血壓和心率變化

各組大鼠給藥前MAP與HR相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；泵注利多卡因4、6 min后，模型組、TEAS Ⅰ組、TEAS Ⅱ組和TEAS Ⅲ組與給藥前比較，MAP與HR差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，各TEAS組注射利多卡因4、6 min后MAP與HR均顯著升高(P<0.05)，且與時間呈正相關(guān)；注射利多卡因4、6 min后各TEAS組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠注射利多卡因后不同時間MAP、HR變化比較

2.2 LDH、CK-MB活性變化

泵注利多卡因6 min后，與空白組比較，模型組、TEAS Ⅰ組、TEAS Ⅱ組和TEAS Ⅲ組大鼠心肌組織中LDH和CK-MB活性顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，TEAS可以顯著降低LDH和CK-MB的活性(P<0.05)，且TEAS Ⅲ組和TEAS Ⅰ組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TEAS Ⅱ組與TEAS Ⅰ和TEAS Ⅲ組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與TEASⅠ組比較cP<0.05。

2.3 T-SOD活力和MDA含量的變化

泵注利多卡因6 min后，與空白組比較，模型組、TEAS Ⅰ組、TEAS Ⅱ組和TEAS Ⅲ組大鼠心肌組織中T-SOD活力顯著降低，MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，TEAS可顯著升高T-SOD活力，降低MDA含量(P<0.05)；各TEAS組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

2.4 NO含量和NOS活性的變化

泵注利多卡因6 min后，與空白組相比，模型組、TEAS Ⅰ組、TEAS Ⅱ組和TEAS Ⅲ組大鼠NO含量和NOS活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，TEAS可顯著升高NO含量和NOS活性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與時間呈正相關(guān)；各TEAS組間NO含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而NOS活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與TEASⅠ組比較cP<0.05。

2.5 心肌細胞中Ca2+含量的變化

泵注利多卡因6 min后，與空白組比較，模型組、TEAS Ⅰ組、TEAS Ⅱ組和TEAS Ⅲ組大鼠心肌細胞中的Ca2+含量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，TEAS可顯著降低Ca2+含量(P<0.05)；隨著刺激時間的增加，Ca2+熒光強度逐漸減弱，且各TEAS組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4～5)。

A.空白組；B.模型組；C.TEASⅠ組；D.TEASⅡ組；E.TEASⅢ組。

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與TEASⅠ組比較cP<0.05。

3 討 論

利多卡因?qū)脔０奉惥致樗帲斔幬锍^機體耐藥量或注射到血管或血液豐富的區(qū)域被吸收過快會引起中毒，主要是對心血管系統(tǒng)的毒性。目前局麻藥引起的中毒通過腎上腺素[7]、脂肪乳[8]、胰島素[9]等藥物治療。有研究報道電針刺激內(nèi)關(guān)穴可減少細胞凋亡并降低自噬水平，降低心肌梗死面積實現(xiàn)對心肌缺血-再灌注大鼠的保護效應[10]。方劍喬等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮穴位電刺激雙側(cè)“曲池”“合谷”“足三里”“三陰交”可能通過提高心肌抗氧自由基能力減少LDH、CK-MB釋放，從而達到心肌保護作用[11]。LDH、CK-MB、NO、NOS是標志再灌注損傷/心肌缺血的重要診斷指標[12-13]，SOD、MDA是機體損傷后反映氧自由基水平的可靠指標[14]。本研究通過20、40和60 min電刺激“內(nèi)關(guān)”、“合谷”、“足三里”和“三陰交”4個穴位，探討了TEAS累加效應對利多卡因所致心臟毒性的影響，并通過測定LDH、CK-MB、SOD、MDA等指標探討可能的機制。

LDH可以判斷心肌損傷程度，CK-MB在臨床上主要用于診斷心梗。心肌受損后，細胞膜通透性增加，心肌細胞中LDH和CK-MB釋放入血，致含量急劇上升[15]。本研究顯示注射利多卡因后大鼠心肌組織中LDH和CK-MB活性顯著升高，而TEAS可以顯著降低兩者的活性，表明TEAS可減輕心肌損傷。

心肌缺血時，氧自由基(OFR)生成增加，形成脂質(zhì)過氧化物，清除氧自由基的SOD活性下降，導致氧自由基堆積，引起心肌細胞內(nèi)一系列改變，最終導致心肌缺血[16]。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量能較好地反映組織脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細胞損傷程度[17]。本研究中注射利多卡因后大鼠心肌組織中T-SOD活力顯著降低，MDA含量顯著升高，TEAS可顯著升高T-SOD活力，降低MDA含量。表明TEAS可通過加強自由基代謝、增強心肌抗氧化能力而保護心臟。

NO是心血管系統(tǒng)中一種重要的生物活性物質(zhì)，其作用是保護血管內(nèi)皮功能、抗氧化和抑制中性粒細胞浸潤[18]。韓宇博等[19]研究表明提高血清中NOS活性，增加NO含量可對缺血的心肌細胞起保護作用。Ca2+可將心臟收縮周期中肌肉收縮和松弛與線粒體能量的產(chǎn)生聯(lián)系起來[20]，有研究表明，細胞內(nèi)Ca2+水平可調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的激活[21]，而持續(xù)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶激活可促進心臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷[22]。本研究中，注射利多卡因后心肌細胞中Ca2+含量明顯增加，而隨著TEAS時間延長，Ca2+熒光強度逐漸減弱，表明TEAS可抑制利多卡因?qū)е碌拇笫笮募〗M織Ca2+水平升高，增加NOS活性，促進NO釋放而達到對心肌的保護作用。

綜上，本研究結(jié)果表明TEAS可降低LDH和CK-MB活性，減輕心肌損傷；升高T-SOD活力，降低MDA含量，加強自由基代謝，增強心肌抗氧化能力；抑制Ca2+水平升高，增加NOS活性，促使NO釋放，進而達到對心臟的保護作用。