吳 月，杜丹丹，官偉寧，左春林

近年來，甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)病率逐年上升，不同人群的患病率高達(dá)19%～67%。超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(ultrasound-guided fine needle aspiration cytology，US-FNAC)是一種創(chuàng)傷小、可靠性高的甲狀腺結(jié)節(jié)評(píng)估手段，但該方法所取細(xì)胞較少，且難以反應(yīng)病灶全貌，仍有約15%～30%病變無法明確診斷。子宮球蛋白相關(guān)蛋白1(uteroglobin-related protein 1，UGRP1)功能尚未明確，在正常人甲狀腺中有少量表達(dá)，與自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis,AITD)的易感位點(diǎn)相關(guān)。通過前期研究表明，UGRP1表達(dá)陽性的格雷夫斯病(graves′ disease，GD)患者行碘131(I)治療后易于發(fā)生甲狀腺功能減退，其表達(dá)受多種細(xì)胞因子調(diào)控。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)為

BRAF

600基因突變較高的腫瘤之一。該研究以FNAC結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)分組，對(duì)疑診甲狀腺癌的甲狀腺結(jié)節(jié)行

BRAF

600基因突變檢測(cè)，通過分析不同性質(zhì)甲狀腺結(jié)節(jié)患者甲狀腺細(xì)胞中UGRP1表達(dá)情況，探討其與甲狀腺功能、性質(zhì)、超聲特征以及與

BRAF

600基因突變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2019年7月—2020年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤細(xì)胞學(xué)室以甲狀腺結(jié)節(jié)為主訴行超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺活檢的131例患者吸取153例甲狀腺組織，每例甲狀腺組織涂片2張，分別進(jìn)行HE染色和UGRP1免疫組化染色。其中選取超聲診斷且細(xì)胞學(xué)證實(shí)的良性結(jié)節(jié)22例，取結(jié)節(jié)旁正常甲狀腺組織作為正常對(duì)照組。部分可疑惡性結(jié)節(jié)36例另取一針，將標(biāo)本置于裂解液中，以熒光PCR法行

BRAF

600基因突變檢測(cè)。本研究通過安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

一抗：兔抗人UGRP1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(1 ∶500)；二抗：PV6000酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(1 ∶1)；PV6000內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、DAB試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；人類

KRAS

/

NRAS

/

BRAF

基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

-20 ℃凍存切片，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑37 ℃烤箱孵育30 min，0.3%TRIton-X100溶液37 ℃烤箱30 min，加入一抗(1 ∶500)， 4 ℃冰箱過夜； 滴加即用型二抗37 ℃烤箱孵育30 min，滴加適量新鮮配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察控制染色時(shí)間，純水洗凈，蘇木精復(fù)染30 s，自來水沖洗10 min，自然風(fēng)干后中性樹脂封片。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

在光鏡下分析，排除非特異染色的前提下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有黃色、棕黃色或棕褐色顆粒的細(xì)胞為UGRP1陽性細(xì)胞。甲狀腺功能、甲狀腺抗體均由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科實(shí)驗(yàn)室以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。B超為彩色多普勒超聲檢查。US-FNAC所得細(xì)胞在光鏡下觀察，細(xì)胞核有異形、可見包涵體診斷為甲狀腺癌，鏡下可見淋巴細(xì)胞且甲狀腺相關(guān)抗體升高診斷為橋本甲狀腺炎，其余診斷為甲狀腺結(jié)節(jié)。

2 結(jié)果

2.1 UGRP1在4組患者甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá)

橋本甲狀腺炎組(38例)、甲狀腺結(jié)節(jié)組(47例)和甲狀腺癌組(46例)UGRP1陽性表達(dá)分別為27例、2例、1例，陽性率分別為71.1%、4.3%、2.1%(見圖1B、C、D)，正常甲狀腺組(22例)中UGRP1陰性表達(dá)(見圖1A)。橋本甲狀腺炎組UGRP1陽性表達(dá)率高于正常甲狀腺、甲狀腺結(jié)節(jié)和甲狀腺癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。正常甲狀腺組、甲狀腺結(jié)節(jié)組、甲狀腺癌組UGRP1陽性表達(dá)率組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 UGRP1陽性組與陰性組的甲狀腺功能比較

根據(jù)UGRP1的表達(dá)情況，將131例患者分為UGRP1陽性組和UGRP1陰性組，結(jié)果顯示，2組血清中三碘甲狀腺氨酸(triiodothyronine，TT3)、甲狀腺素(thyroxine，TT4)、促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。UGRP1陽性組甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibody，ATG)高于UGRP1陰性組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表2。

圖1 UGRP1在甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá) IHC×200

表1 4組甲狀腺細(xì)胞中UGRP1表達(dá)比較

2.3 UGRP1陽性組與UGRP1陰性組的超聲特征比較

UGRP1陽性組與UGRP1陰性組結(jié)節(jié)的回聲、形態(tài)、邊界、有無鈣化、縱橫比、有無腫大淋巴結(jié)、TI-RADS分級(jí)2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，而結(jié)節(jié)的數(shù)目、大小、質(zhì)地、血流情況在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.4 甲狀腺細(xì)胞中UGRP1表達(dá)與

基因突變的相關(guān)性分析

甲狀腺細(xì)胞中UGRP1表達(dá)與

BRAF

600基因突變存在相關(guān)性(

P

=0.023，

C

=0.414)，

BRAF

600基因突變型甲狀腺細(xì)胞其UGRP1表達(dá)傾向于陰性表達(dá)。見表4。

表2 UGRP1陽性組與陰性組的甲狀腺功能、抗體比較

表3 UGRP1陽性組和陰性表達(dá)組的超聲特征比較[n(%)]

表4 UGRP表達(dá)與BRAFV600E基因突變關(guān)系

2.5 二分類logistic回歸分析甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的相關(guān)因素

將TT3、TT4、TSH、TPOAb、ATG、UGRP1作為協(xié)變量(考慮

BRAF

600缺項(xiàng)影響，故未納入)，以甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性作為應(yīng)變量，進(jìn)行二分類logistic回歸分析顯示，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)與UGRP1陽性呈負(fù)相關(guān)(

P

<0.05)。見表5。

表5 二分類logistic回歸分析甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的相關(guān)因素

3 討論

甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)病率在近十余年迅速增長，隨著超聲檢查在體檢中的日益普及，甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率日漸增多，其性質(zhì)判斷成為其評(píng)估要點(diǎn)。US-FNAC是迄今評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)最可靠的手段。根據(jù)Bethesda甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)報(bào)告系統(tǒng)，將FNAC檢查中不能明確診斷其良惡性的結(jié)節(jié)稱為不能確定或可疑的惡性結(jié)節(jié)，這部分甲狀腺結(jié)節(jié)僅20%～25%術(shù)后病理發(fā)現(xiàn)為甲狀腺癌，而另外的患者則實(shí)施了非必要的手術(shù)。因此尋找甲狀腺結(jié)節(jié)診斷的生物學(xué)標(biāo)記物作為輔助診斷的指標(biāo)成為目前研究的關(guān)注點(diǎn)之一。

UGRP1基因定位于人染色體5q31-34，有研究表明該區(qū)域含有哮喘及AITD易感位點(diǎn)，具有潛在的抗炎作用。前期研究顯示，UGRP1在橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織高表達(dá)，并且UGRP1與自殺相關(guān)因子和人類白細(xì)胞DR抗原在甲狀腺細(xì)胞中共表達(dá)。橋本甲狀腺炎超聲影像特點(diǎn)為甲狀腺彌漫性病變，其合并甲狀腺結(jié)節(jié)在臨床上也很常見，橋本甲狀腺炎合并PTC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是非橋本甲狀腺炎的2.8倍，UGRP1高表達(dá)與甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性是否存在關(guān)聯(lián)值得深入探討。

BRAF

600基因突變是PTC中最常見的遺傳變異，總的突變率約為29%～90%，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為

BRAF

基因突變與PTC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

BRAF

基因突變最主要是

BRAF

600點(diǎn)突變，可致使

BRAF

蛋白結(jié)構(gòu)中

V

600

E

的氨基酸突變，從而使

BRAF

激酶發(fā)生持續(xù)性活化。激活絲裂原活化蛋白激酶通路，進(jìn)一步導(dǎo)致癌變。本研究結(jié)果顯示：在以甲狀腺結(jié)節(jié)為主訴的患者中，橋本甲狀腺炎、甲狀腺結(jié)節(jié)和甲狀腺癌患者UGRP1陽性表達(dá)率分別為71.1%、4.3%和2.2%，其表達(dá)與甲狀腺功能無關(guān)，回歸分析顯示甲狀腺癌與UGRP1陽性呈負(fù)相關(guān)。UGRP1陽性表達(dá)的甲狀腺結(jié)節(jié)超聲影像學(xué)表現(xiàn)非低回聲、形態(tài)規(guī)則、邊界清晰、無鈣化、縱橫比<1、無腫大淋巴結(jié)、甲狀腺超聲影像數(shù)據(jù)和報(bào)告系統(tǒng)分級(jí)低級(jí)別等傾向于良性結(jié)節(jié)特征，惡性征象的特征包括微小鈣化、邊緣不規(guī)則和縱橫比>1的甲狀腺結(jié)節(jié)UGRP1表達(dá)為陰性。本研究提示UGRP1可能作為識(shí)別橋本甲狀腺炎的較好指標(biāo)，但不能作為識(shí)別甲狀腺癌的有效標(biāo)記物。

BRAF

600基因突變是目前已知確定的與PTC致病密切相關(guān)的分子標(biāo)記物，探究甲狀腺結(jié)節(jié)UGRP1陽性或陰性表達(dá)與

BRAF

600基因突變型或野生型之間的相關(guān)性顯然具有一定意義，結(jié)果表明甲狀腺結(jié)節(jié)

BRAF

600基因突變型UGRP1呈陰性表達(dá)，從另一方面推測(cè)UGRP1陽性甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)生癌變的可能性不大。