李維娜，劉剛，張歡，朱文兵（1.湖南光琇高新生命科技有限公司，長(zhǎng)沙10001；2.中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院男科學(xué)部，長(zhǎng)沙10081；3.湖南省生殖與遺傳臨床醫(yī)學(xué)研究中心，長(zhǎng)沙10081；.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生殖與干細(xì)胞工程研究所，長(zhǎng)沙10081）

無(wú)頭精子癥（acephalic spermatozoa），又被稱為斷頭精子癥（decapitated spermatozoa或decaudated spermatozoa）或大頭針樣精子癥，指精液中大部分精子呈現(xiàn)精子頭部缺失、頭部與尾部斷開或松散連接。無(wú)頭精子癥是導(dǎo)致男性不育的原因之一，幾乎不可能通過自然妊娠的方式獲得后代。關(guān)于無(wú)頭精子癥遺傳學(xué)病因分析的報(bào)道較少，SUN5［1-2］、PMFBP1［3-4］、TSGA10［5-7］、BRDT［8］基因突變可導(dǎo)致無(wú)頭精子癥。目前對(duì)不同致病基因不同位點(diǎn)變異導(dǎo)致的無(wú)頭精子癥的臨床表型與治療策略尚無(wú)深入研究。本研究招募了10例嚴(yán)重?zé)o頭精子癥患者，通過全外顯子組測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行遺傳學(xué)分析，并對(duì)每種突變類型的精子形態(tài)表型進(jìn)行細(xì)致劃分，為今后無(wú)頭精子癥的治療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2020年1至12月于中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院就診的嚴(yán)重?zé)o頭精子癥患者10例，按《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）評(píng)估特異性精子缺陷。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）婚后同居1年以上，性生活正常，未采取避孕措施的不育男性；（2）資料完整；（3）已找到已知致病基因的變異（包括文獻(xiàn)已報(bào)道的和我們新發(fā)現(xiàn)的）；（4）嚴(yán)重?zé)o頭精子癥（單一畸形率＞70%）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）染色體核型異常；（2）Y染色體微缺失；（3）未找到已知無(wú)頭精子癥相關(guān)基因的變異。本研究獲得中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：LL-SC-2019-018），所有納入研究對(duì)象均被告知本研究的目的以及外周血、精液去向，并簽署了知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集與處理

1.2.1 外周血標(biāo)本采集 采集研究對(duì)象靜脈血2～3 mL于EDTA-K2抗凝管中，-80℃保存。

1.2.2 DNA抽提 取外周血200μL，用外周血DNA抽提試劑盒（GIAGEN）提取基因組DNA，按說明書操作。用Nanadrop2000檢測(cè)DNA濃度及純度。

1.2.3 精液標(biāo)本采集 采集精液樣本前禁欲2～7天，手淫法獲取全部精液于無(wú)菌廣口采精杯中。采精杯注明姓名，檢驗(yàn)申請(qǐng)單上注明采集日期和時(shí)間、未射精天數(shù)，立即放入37℃恒溫箱內(nèi)。待精液完全液化后進(jìn)行檢測(cè)。報(bào)告中注明樣本采集是否完整，尤其注明是否有富含精子的射精最初部分丟失。如有丟失應(yīng)在禁欲2～7 d后再次采集精液做進(jìn)一步檢測(cè)。

1.3 精液常規(guī)分析 按照《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）進(jìn)行操作。先用肉眼觀察精液標(biāo)本的量、顏色、黏稠度及是否液化。如標(biāo)本已經(jīng)液化，用pH試紙測(cè)其pH值。將完全液化后的精液充分混勻，用移液槍吸取3μL精液于一次性精子檢測(cè)板（賽司醫(yī)療科技北京有限公司）中，采用全自動(dòng)精子質(zhì)量分析儀（賽司醫(yī)療科技北京有限公司）對(duì)精子濃度、活力等參數(shù)進(jìn)行分析，人工鏡檢采用Makler計(jì)數(shù)板（以色列Sefi-medical instruments公司）。精液參數(shù)參考區(qū)間：精液量≥1.5 mL，精子濃度≥15×106/mL，前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（PR）≥32%，精子活動(dòng)率≥40%。

1.4 精子巴氏染色 將完全液化后的精液充分混勻，滴10μL精液于潔凈的載玻片上，以45°、1 s的速度刮片，待其自然干燥。根據(jù)《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）提供的改良巴氏染色方法配制染液（蘇木素染色液、EA50染液、橘黃G染液均購(gòu)自BASO公司）并染片。

1.5 臨床資料收集 收集患者的基本資料（性別、年齡、配偶年齡、配偶病史、雙方生育史、吸煙嗜酒史、遺傳性疾病家族史、全身慢性疾病病史、性功能障礙病史、大量吸煙飲酒和長(zhǎng)期接觸有害物質(zhì)史、精索靜脈曲張、生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變、生殖道感染等）；收集患者配偶的實(shí)驗(yàn)室及臨床結(jié)局（助孕方式、卵母細(xì)胞總數(shù)、MⅡ期卵母細(xì)胞數(shù)、受精卵母細(xì)胞數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、臨床妊娠結(jié)局）。

1.6 遺傳學(xué)分析

1.6.1 全外顯子組測(cè)序 收集患者外周血gDNA樣本送武漢華大公司進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（WES）。用Agilent SureSelect version 6捕獲外顯子，采用BGISEQ-500平臺(tái)測(cè)序，測(cè)序深度＞100×，Q30≥80%。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）v0.7.15和GATK軟件進(jìn)行序列比對(duì)和變異識(shí)別，用ANNOVAR工具對(duì)變異進(jìn)行注釋。過濾篩選樣本中的單核苷酸位點(diǎn)變異（single nucleotide variants，SNV）、插入和缺失（insertion-deletion，InDel）：（1）過濾掉ExAC、1000Genomes和gnomAD、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中＞1%的變異；（2）保留位于外顯子區(qū)（錯(cuò)義、無(wú)義、移碼）和剪切區(qū)位點(diǎn)的變異；（3）去掉同義突變（synonymous SNV）；（4）保留ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為“Pathogenic”或“Likely pathogenic”的位點(diǎn)；（5）保留ClinVar、OMIM、HGMD、文獻(xiàn)中已報(bào)道與無(wú)頭精子癥相關(guān)的致病基因突變位點(diǎn)；（6）在小鼠/人睪丸組織中特異性高表達(dá)的純合或雙等位基因雜合突變。

1.6.2 Sanger驗(yàn)證 根據(jù)SUN5（NM_080675.3）、TSGA10（NM_025244.2）、PMFBP1（NM_031293.2）基因序列（GRCh37/HG19），用在線Primer 3.0（http：//primer3.ut.ee）軟件設(shè)計(jì)引物。對(duì)候選致病突變位點(diǎn)所在基因組區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送長(zhǎng)沙擎科公司進(jìn)行雙向Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

1.7 精子表型分析 由同一專業(yè)檢驗(yàn)人員嚴(yán)格按照《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析，在油鏡下計(jì)數(shù)至少200個(gè)精子，計(jì)算正常形態(tài)精子百分率、異常形態(tài)精子百分率、頭部缺陷率、主段缺陷率、尾部缺陷率。

1.8 ICSI治療 通過陰道B超及血清雌二醇（E2）水平監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，卵泡發(fā)育成熟后肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），36 h后在B超引導(dǎo)下取卵，取卵4～6 h后行卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICSI）。男性取精前禁欲2～7 d，采用直接洗滌法優(yōu)化處理精液，由于這些患者精子的頭尾部連接非常脆弱，實(shí)驗(yàn)室工作人員在ICSI操作中必須非常小心（避免造成精子頭尾分離），將完整精子注入卵母細(xì)胞；如果未找到完整的精子，則將分離的精子頭部和尾部全部注入MⅡ卵母細(xì)胞，授精后16～18 h觀察受精情況。根據(jù)Racowesky法對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)級(jí)，D3卵裂球≥6的Ⅰ～Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎；根據(jù)患者胚胎和子宮內(nèi)膜情況取卵后3 d選擇1～2個(gè)新鮮優(yōu)質(zhì)胚胎移植，移植后行黃體支持。移植35 d后B超下見孕囊及原始心管搏動(dòng)為臨床妊娠。

2 結(jié)果

2.1 精液分析和分子遺傳學(xué)分析 在10例嚴(yán)重?zé)o頭精子癥患者（表1）中，鑒定到3個(gè)基因SUN5、TSGA10、PMFBP1的11種純合或雜合變異（表2）。

表1 嚴(yán)重?zé)o頭精子癥患者的精液分析

表2 嚴(yán)重?zé)o頭精子癥患者的致病變異和臨床妊娠結(jié)局

2.2 精子表型分析 無(wú)頭精子主要有2個(gè)亞型［5］：一種是沒有核物質(zhì)的小針頭端；另一種是頭部-中段連接錯(cuò)位的精子［9-10］。我們對(duì)10例嚴(yán)重?zé)o頭精子癥患者的精子形態(tài)進(jìn)行分析（圖1）發(fā)現(xiàn)：（1）即使是同一位患者的無(wú)頭精子都有多種形態(tài)，在2種主要亞型的基礎(chǔ)上，不同精子在結(jié)構(gòu)上有許多細(xì)微的差異（例如：尾部結(jié)構(gòu)的部分缺失、尾部頂端有殘留的胞質(zhì)小滴、無(wú)頭尾部、無(wú)尾頭部、松散的頭部、頭頸部連接錯(cuò)位等）；（2）不同的致病基因（SUN5、TSGA10、PMFBP1）變異可產(chǎn)生類似的無(wú)頭精子癥表型；（3）同一個(gè)致病基因不同位點(diǎn)的變異產(chǎn)生的無(wú)頭精子癥表型沒有明顯差異，但在細(xì)微結(jié)構(gòu)和所占比例上會(huì)有區(qū)別；（4）無(wú)頭精子癥的基因型（指本研究涉及的SUN5、TSGA10、PMFBP1三個(gè)基因，其他基因的情況還有待研究）與巴氏染色表型（不包括透射電鏡）沒有明顯的相關(guān)性。

2.3 ICSI妊娠結(jié)局分析 10例患者ICSI治療周期的結(jié)果見表2。除P9患者未進(jìn)周期外，其他9例患者的受精率為85.79%（169/197），優(yōu)胚率為55.03%（93/169），妊娠率為66.67%（6/9）（3位患者P1、P5、P6未妊娠）。其中P1配偶年齡為51歲，僅獲卵1枚，沒有可移植胚胎。

圖1 10例嚴(yán)重?zé)o頭精子癥患者的精子表型

3 討論

根據(jù)精子的超微結(jié)構(gòu)和遺傳學(xué)變異，可將無(wú)頭精子的頸部斷裂點(diǎn)分為3個(gè)亞型［4，11-12］（圖2）：（1）亞型Ⅰ的斷裂點(diǎn)在2個(gè)中心粒之間。無(wú)尾頭部連接到完整的近端中心粒［10，13］，具有完整的植入窩和基底體［13-15］。（2）亞型Ⅱ的斷裂點(diǎn)在細(xì)胞核和近端中心粒之間，無(wú)尾頭部缺乏植入窩和/或基底體，存在完整的近端和遠(yuǎn)端中心粒［2-3，15-18］。SUN5、HOOK1、PMFBP1基因突變與該類缺陷有關(guān)［2-3，16］。（3）亞型Ⅲ的斷裂點(diǎn)在遠(yuǎn)端中心粒和精子中段之間，在精子尾部的近端可觀察到胞質(zhì)小滴，有/無(wú)不完整的線粒體鞘。TSGA10、BRDT基因突變與該類缺陷有關(guān)。但通過精子巴氏染色并不能有效區(qū)分這3種亞型。精子的中心粒如果不能正常遷移和附著在精子細(xì)胞核的尾極，則精子頭部和尾部會(huì)分別獨(dú)立發(fā)育，產(chǎn)生缺乏頭部或頭部-中段排列異常的精子、無(wú)頭尾和松散的頭部［19-20］。松散的精子頭部在我們的研究中并不常見，因?yàn)樗鼈兺ǔ６急恢С旨?xì)胞吞噬［20-21］。

圖2 無(wú)頭精子癥相關(guān)基因和亞型的模式圖［11］

SUN5蛋白定位于精子頭尾連接處的植入窩和核膜上，可能參與頭尾黏連作用（將耦合裝置與精子頭部細(xì)胞核膜連接）；PMFBP1蛋白定位于SUN5所在位置和節(jié)柱、小頭之間，包含有染色質(zhì)交聯(lián)活性的重要功能結(jié)構(gòu)域Smc；TSGA10蛋白定位于中心粒區(qū)域且可能參與中心粒功能。許多研究者認(rèn)為，父系遺傳的中心粒在胚胎發(fā)育中是必不可少的，因此導(dǎo)致精子沒有近端中心粒的TSGA10突變會(huì)影響ICSI治療中早期胚胎的發(fā)育［9，20，22］。但在本研究中，9例患者的受精率為85.79%，優(yōu)胚率為55.03%，妊娠率為66.67%；10例患者有3例為TSGA10突變（P2、P3、P4），均已成功生育子代；且P3、P4、P8多年前已在我院通過ICSI成功生育第一胎，現(xiàn)為生育二胎再次來(lái)我院行ICSI治療。分析P5、P6失敗原因可能為子宮腺肌癥、宮腔粘連術(shù)后、胰島素抵抗等。因此，我們認(rèn)為ICSI的成功率與患者攜帶的無(wú)頭精子缺陷相關(guān)基因（TSGA10、SUN5、PMFBP1）變異、形態(tài)學(xué)表型無(wú)關(guān)。不同遺傳變異引起的無(wú)頭精子缺陷可能只影響精子形態(tài)，ICSI注入松散的精子頭部或頭尾連接異常的精子，均可以獲得較為理想的受精率，并不影響早期胚胎質(zhì)量和臨床妊娠。同時(shí)，導(dǎo)致植入失敗的女性因素不容忽視。

我們認(rèn)為在治療無(wú)頭精子癥時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。首先，ICSI可用于治療無(wú)頭精子癥。成熟的精子頭部在射精或獲能后從尾部脫落。如果患者射出精液中沒有精子頭部，可從睪丸中收集精子來(lái)進(jìn)行ICSI。第二，即使患者的正常形態(tài)精子百分率是0，100%的精子都是無(wú)頭精子，仍然可以找到幾個(gè)有完整頭部的精子或松散的無(wú)尾精子頭部。第三，確定高比例和單一類型精子畸形患者無(wú)頭精子癥相關(guān)的基因變異和形態(tài)學(xué)亞型在臨床上仍然有一定意義。第四，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究涉及TSGA10、SUN5、PMFBP1三個(gè)基因，不可外推至其他基因。第五，在雙等位雜合子/純合子突變的無(wú)頭精子患者及其配偶中篩選這些已知的致病基因，以避免將突變傳遞給后代。第六，如果配偶同時(shí)攜帶突變，在ICSI移植時(shí)可考慮優(yōu)先女性胚胎［3，23］，盡管ICSI可以解決無(wú)頭精子癥患者的生育問題，男性胚胎有50%的機(jī)會(huì)在成年后面臨與父親相同的不育問題。

綜上所述，ICSI可用于治療無(wú)頭精子癥，不同基因變異引起的無(wú)頭精子缺陷可能只影響精子形態(tài)，可以獲得較為理想的受精率。本研究的患者數(shù)量相當(dāng)有限，仍有待進(jìn)一步的全面研究，為今后無(wú)頭精子癥的治療提供參考策略。