雷明玲，彭?；?，張肄鵬，楊海珊

（1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518110；2.深圳市龍崗區(qū)南灣預(yù)防保健所，廣東深圳 518114）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatic arthritis，RA）是以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要病變的一種全身慢性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎癥、滑膜T 細(xì)胞浸潤(rùn)及滑膜增生，并伴有軟骨和骨的侵蝕及漸進(jìn)性關(guān)節(jié)破壞，其致畸和致殘率高，嚴(yán)重影響人們健康和生活質(zhì)量[1-2]。但RA 發(fā)病機(jī)制至今不明，有研究表明，RA 發(fā)病可能與炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)，其中白介素-17（IL-17）是輔助性T 細(xì)胞17（Th17）分泌的一種主要效應(yīng)因子，能誘發(fā)并促進(jìn)炎癥發(fā)生，與RA 發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3-5]。IL-38 是最近新發(fā)現(xiàn)的一種抑炎因子，與IL-36 受體結(jié)合，能抑制Th17 相關(guān)細(xì)胞因子如IL-17，IL-22 等的合成，在自身免疫性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抗炎作用[6-8]。同時(shí)研究表明，IL-17基因單核苷酸多態(tài)性可影響IL-17 的產(chǎn)生而與多種自身免疫性疾病有關(guān)，其中IL-17F 基因多態(tài)性與RA 發(fā)病相關(guān)性已見(jiàn)報(bào)道[9]，但I(xiàn)L-17A 基因多態(tài)性與RA 發(fā)病相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道，且基因多態(tài)性分布具有區(qū)域和種族性差異。為此，本研究對(duì)深圳地區(qū)103 例RA 患者和116 例非RA 健康人群IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)多態(tài)性與血清中IL-17A，IL-38水平表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了對(duì)比分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019年2月～2020年10月在深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院確診的RA 患者103 例，其中男性27 例，女性76 例，男∶女為1∶2.81，年齡35～72 歲，平均年齡49.63±12.75 歲。所有患者均符合RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)RA 疾病活動(dòng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（DSA280）[10]進(jìn)行分期，其中輕度活動(dòng)組29 例（DSA28＜3.2），中度活動(dòng)組56 例（3.2＜DSA28＜5.1），高度活動(dòng)組18 例（DSA28＞5.1）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初確診者；③未使用抗風(fēng)濕藥；④醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)；⑤患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他自身免疫性疾病者；②病情加重者；③伴有腫瘤、糖尿病及血液等疾病者；④伴有嚴(yán)重器質(zhì)性病變者；⑤需采取非常規(guī)治療者；⑥懷孕及哺乳期婦女。選擇同期非RA 疾病的健康人群116 例，其中男性31 例，女性85 例，男∶女為1∶2.74，年齡33～74 歲，平均年齡50.27±13.52 歲，均無(wú)自身免疫性疾病、骨及關(guān)節(jié)相關(guān)性疾病。確保兩組的年齡、性別及男女比例等一般性資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑 DXI800 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀由美國(guó)Bankman 公司提供；DNA 提取試劑盒由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供；ABI7500 PCR基因擴(kuò)增儀由美國(guó)ABI 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：于清晨空腹采集5 ～6ml 靜脈血，其中2～3ml 加入乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管內(nèi)上下充分顛倒混勻用于全血DNA 提取，剩余的加入無(wú)抗凝劑的一次性干燥管內(nèi)，30min 后分離血清用于IL-17A，IL-38 及RF 水平檢測(cè)。

1.3.2 IL-17A，IL-38 及RF 水平測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中IL-17A 和IL-38水平，RF 水平采用免疫比濁法進(jìn)行檢測(cè)，所有操作均嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，并由專人成批次檢測(cè)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。

1.3.3 全血DNA 提?。翰捎肈NA 提取試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供）提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞的基因組DNA，對(duì)合格的DNA 提取標(biāo)本用雙蒸水稀釋至100ng/L，于-20℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.4 多態(tài)性分析：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）法對(duì)IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，具體操作參照文獻(xiàn)[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5 軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用方差檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組IL-17A，IL-38 及RF 水平比較 見(jiàn)表1。RA 組IL-17A 和RF 水平比對(duì)照組明顯升高，而IL-38 水平比對(duì)照組明顯降低，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 兩組IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.2 RA 組不同活動(dòng)度患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較 見(jiàn)表2。RA 組隨著病情活動(dòng)度的加重IL-17A 和RF 水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，不同活動(dòng)度間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 RA 組不同活動(dòng)度患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.3 兩組IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)基因型和等位基因檢出率比較 見(jiàn)表3。RA 組IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)AA 基因型和A 等位基因檢出率比對(duì)照組明顯升高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 兩組IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)基因型和等位基因檢出率比較[n(%)]

2.4 RA 組不同基因型患者IL-17A，IL-38 及RF水平比較 見(jiàn)表4。RA 組AA 基因型IL-17A 水平比AG 和GG 基因型明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，不同基因型之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但不同基因型RF 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 RA 組不同基因型患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.5 RA 組IL-17A 與IL-38，RF 水平相關(guān)性分析 RA組IL-17A 和RF 水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示RA 組血清中IL-17A 與RF 水平呈正相關(guān)（r=0.5012，P＜0.05），而與IL-38 水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.6924，P＜0.05）。

3 討論

IL-17 主要由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的一種早期啟動(dòng)因子，與受體結(jié)合后，可通過(guò)絲裂原活化蛋白（MAP）激酶和核轉(zhuǎn)錄因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途徑促進(jìn)T 細(xì)胞激活和刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，IL-8，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）、化學(xué)增活素及細(xì)胞黏附分子1（cellular adhesion molecule 1，CAM-1）等多種細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生。另外，IL-17 還可通過(guò)促進(jìn)釋放前炎性細(xì)胞因子來(lái)放大炎癥反應(yīng)。有研究表明，IL-17 與RA 的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，甚至發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[4-5,12]。RF 是一種抗人或動(dòng)物IgG 分子Fc 片段抗原決定簇的自身抗體，與體內(nèi)變性結(jié)合形成免疫復(fù)合物是導(dǎo)致自身免疫病骨關(guān)節(jié)損傷的主要病理基礎(chǔ)，與關(guān)節(jié)、骨侵蝕及關(guān)節(jié)外表現(xiàn)發(fā)病有一定關(guān)系，可作為評(píng)價(jià)RA 病情與預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，是診斷RA 最早的血清學(xué)指標(biāo)[13]。IL-38 是IL-1 家族成員之一，可與IL-1R1，IL-36R及類IL-1R 輔助蛋白1（IL-1RAPL1）結(jié)合，可通過(guò)抑制NF-kB，絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）及磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等下游信號(hào)通路，抑制許多炎癥因子產(chǎn)生而發(fā)揮抑炎作用。同時(shí)IL-38 可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，繼而抑制Th17 細(xì)胞反應(yīng)。此外，IL-38 還可調(diào)控滑膜成纖維細(xì)胞，抑制骨質(zhì)破壞與血管生成。有研究表明，IL-38 在RA 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要的抑炎作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，RA 組IL-17A 和RF水平明顯升高，且隨著病情活動(dòng)度加重而明顯上升，與有關(guān)文獻(xiàn)[3-4,13]報(bào)道基本一致，這表明IL-17A 在RA 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的促炎角色，可能是促進(jìn)RA 炎癥反應(yīng)的重要觸發(fā)因子，從而引起RF 水平升高。而IL-38 水平明顯降低，與張繼云等[7]報(bào)導(dǎo)的基本一致，而與肖盼盼等[4]報(bào)導(dǎo)的不同，這可能與不同機(jī)構(gòu)所收集的RA 患者病情嚴(yán)重程度不同有關(guān)，但I(xiàn)L-38 水平隨病情活動(dòng)度加重而明顯下降的結(jié)論基本一致，這表明了在RA 發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中IL-38 水平降低會(huì)導(dǎo)致其對(duì)炎癥的抑制作用減弱，從而導(dǎo)致促炎因子大量產(chǎn)生，加速疾病的進(jìn)程。此外，結(jié)果還顯示，RA 組IL-17A 與RF 水平呈正相關(guān)，而與IL-38 水平呈負(fù)相關(guān)，這可能與IL-17A 的促炎和IL-38 的抑炎互相作用有關(guān)。

RA 病因與發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，多數(shù)研究者認(rèn)為RA 發(fā)病是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子基因多態(tài)性可增加RA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與RA 的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系[16-17]。IL-17A 位于一個(gè)與RA 相關(guān)的基因組區(qū)域的染色體6p12 上，其基因多個(gè)位點(diǎn)存在多態(tài)性。有研究表明，IL-17A 基因位點(diǎn)多態(tài)性與RA 發(fā)病有關(guān)，且存在區(qū)域和種族性差異，如LEE 等[18]研究發(fā)現(xiàn)高加索人RA 患者與健康人群IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)基因型及等位基因頻率存在明顯差異，與RA 發(fā)病有密切關(guān)系，而DHAOUADI 等[19]研究發(fā)現(xiàn)與突尼斯地區(qū)RA 易感性缺乏相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)RA患者IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)AA 基因型和A等位基因檢出率比健康人群明顯升高，這表明IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)多態(tài)性與深圳地區(qū)RA 發(fā)病有一定相關(guān)性。同時(shí)AA 基因型RA 患者IL-17A水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，這可能與IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)多態(tài)性能提高IL-17，其他促炎細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)水平，進(jìn)而抑制抑炎因子水平及功能等有關(guān)。

綜上所述，RA患者IL-17A和RF水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，且與病情的活動(dòng)度有密切關(guān)系，加強(qiáng)IL-17A，RF 和IL-38 水平檢測(cè)對(duì)RA 的診斷及嚴(yán)重程度的判別診斷具有重要的參考價(jià)值。同時(shí)IL-17A基因rs2275913位點(diǎn)多態(tài)性與深圳地區(qū)RA 發(fā)病易感性具有相關(guān)性，其中AA 基因型可能是該地區(qū)RA 發(fā)病的易感危險(xiǎn)基因之一。