李夢(mèng)茜，黃惠彬，龍潔云，張振旺

(1.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 河池 546300；2.湖北科技學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437000；3.湖北科技學(xué)院 醫(yī)藥研究院，湖北 咸寧 437000)

重金屬引起的環(huán)境污染日益受到關(guān)注，從受污染的土壤和水體中去除重金屬對(duì)環(huán)境保護(hù)至關(guān)重要。目前，去除廢水中重金屬的方法主要有化學(xué)沉淀法、離子交換法、膜技術(shù)和生物吸附法等[1-2]。相較其他方法，生物吸附法具有成本低、無二次污染、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注[3-4]。細(xì)菌[5-7]、霉菌[8-9]、微藻類[10-11]和酵母[12-13]均能產(chǎn)生吸附活性物質(zhì)，可用于吸附去除重金屬。目前關(guān)于微生物絮凝劑的大部分研究集中在微生物對(duì)重金屬離子的吸附特性及耐受吸附機(jī)制等方面[14-15]。

抗重金屬微生物的分離對(duì)于發(fā)揮微生物在環(huán)境保護(hù)中的作用具有重要意義。試驗(yàn)從鎘污染河道底泥分離篩選出一株抗鎘菌株，通過形態(tài)觀察、生化生理特性和ITS序列分析，對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，并考察其絮凝活性和對(duì)重金屬(鎘、銅、鉻、汞、鉛、鋅)的抗性，以期為用于從廢水中去除重金屬鎘提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑及設(shè)備

試驗(yàn)主要試劑：蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉，均為化學(xué)純，西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品；硝酸、PbCl2、CdCl2、CuCl2、ZnCl2、K2Cr2O7、HgCl2、均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品；高嶺土，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品。

主要設(shè)備：火焰原子吸收分光光度計(jì)，WFX-110B型，廣州賽福斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，ZWY1102C型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；酶標(biāo)儀，xMark型，美國(guó)Bio-Rad公司；電子掃描顯微鏡，Phenom Pro X型，荷蘭Phenom-World公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐鎘菌株的分離篩選

從廣西南丹縣某礦區(qū)附近采集鎘污染水體污泥樣品。用去離子水溶解氯化鎘制備濃度0.2 mol/L鎘原液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

LB培養(yǎng)基的組成：酵母提取物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L。

將10 g污泥加入到90 mL滅菌水中，在磁力攪拌器上攪拌30 min，使土壤中的細(xì)菌完全分離。培養(yǎng)20 min后進(jìn)行梯度稀釋，取10-5、10-6梯度各100 μL分別涂布到含2 mmol/L Cd的LB固體培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃下培養(yǎng)4 d。挑取平皿中菌落形態(tài)不同的單菌落用劃線法接種于分別含1～20 mmol/L Cd的固體LB培養(yǎng)基上，檢測(cè)各菌株對(duì)Cd的耐受性。選擇耐受最高Cd濃度的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。在固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落并劃線，反復(fù)上述操作直至得到純化菌株。

1.2.2 菌株鑒定

首先觀察菌株瓊脂平板菌落形態(tài)、顯微孢子形態(tài)。收集菌絲體,置于無菌研缽中，反復(fù)研磨后用基因組DNA提純?cè)噭┖刑崛』蚪MDNA，用通用ITS序列引物ITS-1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS-4(5’-CCTCCGCTTA-TTGATATGC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增ITS基因片段[16]。擴(kuò)增出預(yù)期大小的ITS序列(0.7 kb)的PCR產(chǎn)物，用凝膠提取試劑盒純化后送上海生工公司測(cè)序。測(cè)序得到的ITS序列提交Gen Bank數(shù)據(jù)庫，并與相似序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。用CLUSTAL W.軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 對(duì)其他重金屬的抗性

最低抑菌濃度(MIC)是指完全阻止菌株生長(zhǎng)的最低金屬濃度。其他重金屬CuCl2、K2Cr2O7、ZnCl2、HgCl2和PbCl2原液按照Cd原液配制方式配制(0.2 mol/L)。在LB瓊脂平板上分別添加不同濃度的5種重金屬溶液，將菌株劃線接種于平板上。于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后，測(cè)定各重金屬的MIC。用實(shí)驗(yàn)室保藏的白色念珠菌進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.4 抗鎘菌株的絮凝活性評(píng)價(jià)

用高嶺土懸濁液測(cè)定菌株L202002的絮凝活性[17]。將1 mL菌株發(fā)酵液上清液、2.5 mL CaC12溶液(1%)、46.5 mL高嶺土懸濁液(4 g/L)在離心管中混合，用磁力攪拌器攪拌并靜置10 min，從離心管上層吸取2 mL上清液于24孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm處的吸光度(B)。用同樣方式加入不含菌的LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè)定550 nm處的吸光度(A)。同時(shí)加入市售聚丙烯酰胺絮凝劑作為陽性對(duì)照。絮凝率計(jì)算公式如下：

式中：μ—絮凝率，%；D1——對(duì)照組吸光度；D2—加入菌株發(fā)酵液的吸光度。

用SEM觀察高嶺土被絮凝前、后的形貌特征，闡明菌株的絮凝活性機(jī)制。

1.2.5 菌株的除鎘性能評(píng)價(jià)

菌株對(duì)鎘的去除性能用搖瓶進(jìn)行初步測(cè)定。將9個(gè)裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶標(biāo)記為1#～9#，分組如下：A組，1#～3#；B組，4#～6#；C組，7#～9#。A組的3瓶未接種，B組和C組的6瓶接種。9個(gè)搖瓶均放于溫度30 ℃、 振蕩速度180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，C組3瓶培養(yǎng)物在121 ℃條件下滅菌10～15 min，直至菌體幾乎全部滅活。然后將CdCl2·6H2O加入到9個(gè)培養(yǎng)瓶中，得到Cd最終濃度為2 mmol/L。9個(gè)培養(yǎng)瓶繼續(xù)放在搖床中培養(yǎng)24 h，每個(gè)培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)物以5 000 r/min速度離心10 min，然后用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定上清液中Cd濃度，計(jì)算Cd去除率(η)。

式中：c0—未接菌培養(yǎng)液中Cd濃度，mol/L；c1—接菌培養(yǎng)液中Cd濃度，mol/L。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選與鑒定

從污泥中篩選抗鎘菌株，經(jīng)固體瓊脂平板劃線純化，獲得一批抗鎘菌株，其中一株在含19 mmol/L Cd的瓊脂平板上培養(yǎng)3 d仍有少量小菌落，當(dāng)Cd濃度增至20 mmol/L培養(yǎng)7 d時(shí)，平板上無菌落形成。重復(fù)培養(yǎng)3次，菌株抗鎘性能穩(wěn)定。該菌株命名為菌株L202002。

2.1.1 L202002的培養(yǎng)與理化特征

L202002菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈絨毛狀、輻射狀生長(zhǎng)，菌落中央為土黃色(圖1(a))；LB液體培養(yǎng)條件下形成菌絲球，菌絲絨毛狀(圖1(b))；孢子梗頂端分散著球形顆粒狀分生孢子，顯微鏡下孢子呈黃綠色菊花樣顆粒(圖1(c))。碳氮源是構(gòu)成微生物細(xì)胞的最重要的營(yíng)養(yǎng)成分，利用和分解碳、氮源的能力是微生物重要的生理生化特征，在微生物的鑒別和分類時(shí)占有重要地位[18]。菌株L202002利用碳氮源的情況見表1，可以看出，L202002菌株的形態(tài)和理化特征與曲霉屬較為一致。

a—平板菌落；b—液體培養(yǎng)菌絲球；c—鏡檢孢子形態(tài)(1 000倍)。圖1 菌株L202002的培養(yǎng)特征

表1 菌株L202002的生化特征

2.1.2 菌株的ITS序列測(cè)序

對(duì)菌株L202002提取總DNA后送上海生工測(cè)序，ITS序列提交到Gen Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果表明，L202002與曲霉菌(Aspergillus)的ITS序列同源性在98%以上。為進(jìn)一步確定菌株L202002與其他霉菌的親緣關(guān)系，選取30株同源性較高的菌株構(gòu)建基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。

圖2 L202002菌株基于ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

可以看出：L202002與土曲霉(Aspergilluscejpii)位于同一分支上，具有較近的遺傳距離。綜合形態(tài)特征、生理生化特征和ITS序列分析，菌株L202002被鑒定為土曲霉。

2.2 其他重金屬離子對(duì)菌株L202002的最低抑菌濃度(MIC)

菌株L202002可以在高濃度Cd、Cu、Cr、Hg、Pb、Zn培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。Cu、Zn是微生物必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，其他元素Cd、Cr、Hg和Pb對(duì)細(xì)胞有致命作用，通常在微摩爾或毫摩爾濃度下具有毒性。菌株L202002對(duì)幾種重金屬Cd、Cu、Cr、Hg、Pb和Zn的MIC見表2?？梢钥闯?，菌株L202002對(duì)這幾種重金屬都有抗性，抗性順序?yàn)镃d>Zn>Cu>Cr>Hg>Pb。菌株L202002對(duì)重金屬的抗性遠(yuǎn)高于白色念珠菌。

表2 菌株L202002對(duì)幾種重金屬的MIC mmol/L

2.3 L202002菌株的絮凝性能

L202002菌株對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝效果如圖3所示。可以看出，L202002菌株對(duì)高嶺土懸濁液表現(xiàn)出很好的絮凝效果，與市售絮凝劑聚丙烯酰胺的絮凝效果相當(dāng)。L202002菌株的絮凝活性產(chǎn)物在添加量為30 mg/L時(shí)對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝率高達(dá)100%。

a—高嶺土懸濁液；b—加L202002菌液；c—加聚丙烯酰胺。圖3 L202002菌株對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝效果

2.4 菌株L202002的絮凝機(jī)制

高嶺土溶液絮凝前、后SEM分析結(jié)果如圖4所示。可以看出，分散的高嶺土細(xì)小顆粒被菌株絮凝活性產(chǎn)物通過架橋吸附作用像編織網(wǎng)一樣緊密地連接在一起，并且易于與溶液分離。高嶺土膠?？梢詮?qiáng)烈地吸附在多糖絮凝劑分子鏈功能團(tuán)上，且吸附在鏈上的膠粒可以同時(shí)被其他分子鏈吸附，產(chǎn)生架橋連接，從而形成容易沉降的三維絮體；在沉降過程中絮體相互碰撞和卷掃形成粗大的絮凝團(tuán)，從而加速高嶺土的沉降[19-20]，因此推斷，菌株L202002絮凝活性產(chǎn)物主要是通過架橋吸附和網(wǎng)捕卷掃機(jī)制完成對(duì)高嶺土顆粒的吸附。

圖4 高嶺土絮凝前(a)、后(b)的SEM圖像

2.5 菌株L202002對(duì)溶液中Cd的去除

菌株L202002對(duì)Cd的去除效果見表3?？梢钥闯觯築組和C組平均Cd質(zhì)量濃度明顯低于A組，考慮到時(shí)間和能耗成本，以處理24 h為宜；與不接種菌株的A組相比，B組的平均Cd質(zhì)量濃度下降162.2 mg/L，C組的平均Cd質(zhì)量濃度下降138.4 mg/L，這表明菌株L202002具有良好的金屬去除性能，活菌和死菌均能有效去除溶液中的Cd。

表3 菌株L202002對(duì)Cd的去除效果

研究重金屬環(huán)境中微生物的生長(zhǎng)情況對(duì)于治理重金屬污染至關(guān)重要[21-22]。一般來說，微生物去除重金屬的過程包括生物吸附和生物積累[23]。生物吸附過程是指微生物通過配合、螯合、離子交換、吸附等生化反應(yīng)吸附金屬離子，活細(xì)胞和非活細(xì)胞都有生物吸附作用；生物積累通常只發(fā)生在活細(xì)胞中，是一個(gè)活躍的過程，需要微生物新陳代謝提供能量。死菌在生物修復(fù)方面比活菌更好，因?yàn)樗谰粫?huì)受金屬毒性的影響[24]；但活細(xì)胞對(duì)金屬的去除率要高于非活細(xì)胞對(duì)金屬的去除率[25]。其原因可能是菌株對(duì)Cd的抗性較強(qiáng)，而Cd對(duì)菌株生命的影響較小。在吸附去除過程中，活細(xì)胞通過生物吸附和生物積累去除Cd，而非活細(xì)胞只能通過生物吸附來去除Cd。因此，活細(xì)胞對(duì)Cd的去除能力要好于非活細(xì)胞。

3 結(jié)論

1)分離得到的菌株L202002為土黃色絨毛狀，孢子呈黃綠色菊花樣顆粒，液體培養(yǎng)條件下形成菌絲球，被鑒定為曲霉菌Aspergilluscejpii。

2) 菌株L202002對(duì)Cd有較強(qiáng)的耐受性，對(duì)固體平板上的其他金屬，如Zn、Cu、Pb、Hg也有較好的耐受性；并且，對(duì)高嶺土懸濁液表現(xiàn)出很好的絮凝活性。

3) 菌株L202002的活細(xì)胞和非活細(xì)胞都能去除溶液中的Cd，經(jīng)活細(xì)胞、非活細(xì)胞處理24 h后的Cd平均質(zhì)量濃度分別下降162.2、138.4 mg/L，相應(yīng)的Cd去除率分別為73.5%、62.7%。

4)由于菌株L202002對(duì)其他重金屬亦有很好的耐受性，且對(duì)高嶺土懸濁液有良好的絮凝活性，所以，進(jìn)一步研究菌株的抗Cd機(jī)制及絮凝活性產(chǎn)物對(duì)重金屬污染水的治理有一定意義。