莫 樞，孫柯煥，崔 琰，梅雯慧，彭勛潛，何海濱，彭博佳，朱曉峰，張榮華△

（暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，2中醫(yī)學(xué)院，3藥學(xué)院，廣東廣州510630）

基于高濃度NaCl增加尿鈣排泄的原因，高鹽飲食成為骨質(zhì)疏松的主要危險(xiǎn)因素。研究顯示攝入食鹽量與尿鈣的排泄呈正相關(guān)［1］，長(zhǎng)期高鹽飲食所導(dǎo)致的尿鈣排泄增加可以減少骨量，增加骨吸收，繼而誘發(fā)骨質(zhì)疏松或加重其發(fā)展［2-3］。

高鹽飲食導(dǎo)致鈉在腎小管的重吸收減少，進(jìn)而平行減少了鈣的重吸收。腎小管重吸收過(guò)程中，其分布的一些離子通路調(diào)節(jié)著機(jī)體的鈣平衡，對(duì)骨代謝起著重要作用，如鈉氯同向轉(zhuǎn)運(yùn)體NCC（Na-Cl cotransporter，NCC）和電壓門控性氯離子通道5（voltage-gated chloride channels 5，CLC-5）［4-6］。NCC是一個(gè)具有同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)鈉、氯離子功能的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與機(jī)體血壓、血鉀、酸堿平衡和尿鈣排泄的調(diào)節(jié)［4-5］。抑制NCC可通過(guò)增加礦化結(jié)節(jié)的形成［7］及成骨細(xì)胞分化而提高骨密度［8］。CLC-5主要影響近端腎小管對(duì)氯離子的重吸收，影響尿鈣排泄［6］，其基因缺失將導(dǎo)致Dent′s病和X連鎖隱性低磷性佝僂病，二者主要表現(xiàn)為高尿鈣及佝僂?。?］。

補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方（nourishing kidney and activating blood recipe，NKABR）由淫養(yǎng)藿、杜仲、枸杞子、龜板、熟地、牛膝、當(dāng)歸和秦艽組成，具有補(bǔ)腎壯骨、活血止痛的功效。既往研究顯示，補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方含藥血清（nourishing kidney and activating blood recipe serum，NKABRS）能促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及礦化能力［10-11］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明NKABR能顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度，提高大鼠血清中與骨重建相關(guān)因子的表達(dá)［12-13］；在臨床上NKABR可提高骨質(zhì)疏松患者的骨密度，緩解骨痛癥狀［14］，但以上研究均以“骨”為直接檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?，基于“咸入腎，腎主骨，過(guò)咸傷骨”理論，本項(xiàng)工作以體外的大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E作為研究模型，從“腎”方面對(duì)高濃度NaCl及NKABRS能否通過(guò)調(diào)控NCC和CLC-5發(fā)揮骨代謝影響作用進(jìn)行探討。

材料和方法

1 細(xì)胞

大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

2 動(dòng)物

SPF級(jí)2月齡雌性SD大鼠30只，體重180～200 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）2014-0007；動(dòng)物飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（粵）2017-0174。

3 藥物

NKABR藥物由淫養(yǎng)藿、杜仲、枸杞子、龜板、熟地、牛膝、當(dāng)歸和秦艽組成。補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方液體提取物（由廣州博濟(jì)醫(yī)療生物科技有限公司提取，批次編號(hào)：20150601）。

4 主要試劑

注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）；氯化鈉分析純（廣州化學(xué)試劑廠）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為Biological Industries產(chǎn)品；DMEM低糖培養(yǎng)液（Gibco Life Technologies）；CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（Dojindo）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒（Thermo Fisher Scientifc）；骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）和NCC抗體（Stress Marq）；1α-羥化酶（CYP27B1）抗體（Rab MAb）；骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體（Affinity Biosciences）；CLC-5抗體（Zen-Bio）；GAPDH抗體和實(shí)驗(yàn)中所用Ⅱ抗（Cell Signaling Technology）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；免疫熒光試劑盒（碧云天生物技術(shù)研宄所）。

5 主要方法

5.1 NKABRS的制備取SPF級(jí)2月齡雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照（control）組與NKABR組，每組各15只，以制備對(duì)照血清（control-serum，Control-S）和NKABRS。灌胃給藥：參考既往研究文獻(xiàn)［15］，NKABR組予NKABR 23.4 g·kg-1·d-1灌胃，control組以等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃7 d，每天1次。采取血清的方法參考既往研究文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。

5.2 NRK-52E細(xì)胞的培養(yǎng)及藥物干預(yù)NRK-52E細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下，用含5%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液（NaCl濃度為0.11 mol/L）培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)液同步化24 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分4部分進(jìn)行。第一部分，NaCl對(duì)細(xì)胞活力的影響：細(xì)胞分為對(duì)照（control）組、0.15 mol/L NaCl組、0.25 mol/L NaCl組、0.35 mol/L NaCl組和0.45 mol/L NaCl組，培養(yǎng)后測(cè)定細(xì)胞活力。第二部分，NKABRS對(duì)細(xì)胞活力的影響：NKABRS濃度參考既往研究文獻(xiàn)［10-11］，細(xì)胞分為control組（加入等體積含5%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液）、Control-S組（分別加入等體積含3%、5%、7%、9%Control-S的DMEM低糖培養(yǎng)液）、NKABRS組（分別加入等體積含3%、5%、7%、9%NKABRS的DMEM低糖培養(yǎng)液）、NaCl組（加入等體積含0.25 mol/L NaCl的DMEM低糖培養(yǎng)液）、NaCl+NKABRS組（加入等體積含0.25 mol/L NaCl和5%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液），培養(yǎng)后測(cè)定細(xì)胞活力。第三部分，NKABRS（3%）及NaCl（0.25 mol/L）對(duì)細(xì)胞的影響：細(xì)胞分為control組、NaCl組及NaCl+NKABRS組，加入相應(yīng)培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞24 h。第四部分，NCC和CLC-5基因沉默處理分組：NCC基因沉默后，細(xì)胞分為control組、NaCl（0.25 mol/L）組、NaCl+NKABRS（3%）組、si-NC+NaCl+NKABRS組（在轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞中加入等體積含0.25 mol/L NaCl和3%NKABRS的DMEM低糖培養(yǎng)液）、si-NCC+NaCl+NKABRS組（在轉(zhuǎn)染NCC siRNA的細(xì)胞中加入等體積含0.25 mol/L NaCl和3%NKABRS的DMEM低糖培養(yǎng)液），細(xì)胞均干預(yù)培養(yǎng)24 h；CLC-5基因沉默后，細(xì)胞分為control組、si-NC+0.11 mol/L NaCl組（在轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞中加入等體積含0.11 mol/L NaCl和5%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液）、si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl+NKABRS組（在轉(zhuǎn)染CLC-5 siRNA的細(xì)胞中加入等體積含0.11 mol/L NaCl和3%NKABRS的DMEM低糖培養(yǎng)液），各組細(xì)胞均干預(yù)24 h。

5.3 CCK-8檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞活力細(xì)胞以1×107/L的密度接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。藥物作用6、12和24 h后每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育2 h，使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad）檢測(cè)450 nm處吸光度（A）值。并用SPSS軟件計(jì)算（Bliss法）24 h細(xì)胞半數(shù)致死量（LD50）。

5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率0.05%胰蛋白酶消化各組細(xì)胞（1×106）并收集至離心管中，加入5%FBSDMEM低糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，于高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心，并抽棄上清液后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心并抽棄上清液，加入300μL的1×Binding Buffer結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL的Annexin V-FITC溶液均勻混合，于25℃下避光靜置15 min。使用流式細(xì)胞儀（FACSAria，Becton Dickinson）檢測(cè)前加入5μL的PI溶液染色5 min，。

5.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證siRNA由廣州維伯鑫生物科技股份有限公司根據(jù)NCC和CLC-5的基因序列設(shè)計(jì)并合成。基因序列如下：CLC-5 siRNA-1：5′-GGACCUAUGAUGAUUUCdTdT-3′；CLC-5 siRNA-2：5′-CCGCUCCAUCAAUCCAUdTdT-3′；CLC-5 siRNA-3：5′-CCACUUCAACACUAGCadTdT-3′；NCC siRNA-1：5′-CCUACGAACACUACGCudTdT-3′；NCC siRNA-2：5′-CCAGGUGCUGU CUUUCdTdT-3′；NCC siRNA-3：5′-GGUCAUCAUGUUCCUGCdTdT-3′。

抽棄6孔板中原有培養(yǎng)液，每孔用2 mL新鮮培養(yǎng)液代替。25℃下均勻混合125μL DMEM低糖培養(yǎng)液和各組siRNA后加入4μL Lipofectamine 8000轉(zhuǎn)染試劑均勻混合。將該混合物逐滴加入各組細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)48 h。RT-qPCR鑒定siRNA是否轉(zhuǎn)染成功。

5.6 免疫熒光檢測(cè)CLC-5、NCC和OPN的蛋白含量及分布4%甲醛溶液固定細(xì)胞10 min，100%冰乙醇室溫封閉1 h。免疫染色洗滌液洗滌3次，加入NCC（1∶200）、CLC-5（1∶100）Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜。免疫染色洗滌液洗滌3次，Cy3熒光標(biāo)記Ⅱ抗（1∶1 000）室溫避光輕搖孵育1 h。抽棄Ⅱ抗，加入細(xì)胞染色液DAPI，室溫避光染色5 min。PBS避光洗滌3次。滴加抗熒光淬滅劑，封片。使用倒置熒光顯微鏡（Leica）、Imaris 4.0軟件獲取細(xì)胞的熒光圖像。

5.7 RT-qPCR檢測(cè)CLC-5、NCC、BMP-7、CYP27B1和OPN的mRNA表達(dá)PBS洗滌細(xì)胞2次，用Trizol試劑提取總RNA。使用分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞RNA純度（每樣品A260/A280比在1.8～2.1之間）。每組取2 μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用iQTM5系統(tǒng)（Bio-Rad）與SYBRGreen試劑一式三份進(jìn)行qPCR分析。使用特異引物，每25μL反應(yīng)中總共添加100 ng總RNA。引物的序列如下：BMP-7正向引物序列為5′-AGTGGAGCACGACAAGGAAT-3′，反向引物序列為5′-TAGATCCTGAACTCGGCTGC-3′；CYP27B1正向引物序列為5′-CCCAGCTACCCCTGCTAAAG-3′，反向引物序列為5′-TCTGCCAAGCGTCTCCCTAT-3′；NCC正向引物序列為5′-TTGGAAGGAAGGGGAAGTGC-3′，反向引物序列為5′-CTGCCACACTGGACATCACT-3′；CLC-5正向引物序列為5′-ATGATGCCCACATCCGTCTC-3′，反向引物序列為5′-CGGGGCTT-CATCACATCCAT-3′；OPN正向引物序列為5′-AGCCATGAGTCAAGTCAGCT-3′，反向引物序列為5′-ACTCGCCTGACTGTCGATAG-3′；內(nèi)參照GAPDH正向引物序列為5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，反向引物序列為5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。執(zhí)行以下循環(huán)條件：95℃2 min；94℃20 s，58℃20 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt定量方法分析mRNA表達(dá)量。

5.8 Western blot法檢測(cè)CLC-5、NCC、BMP-7、1α-羥化酶和OPN的蛋白表達(dá)預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，在冰上用預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液RIPA裂解細(xì)胞后提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度并將其調(diào)整一致。每泳道予等量的蛋白質(zhì)（30μg）通過(guò)SDS-PAGE后分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含有0.05%Tween-20和5%脫脂奶粉的緩沖液輕搖封閉PVDF膜1 h，加入目標(biāo)蛋白Ⅰ抗（1∶1 500）4℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后加入Ⅱ抗（1∶3 000）室溫輕搖孵育1 h。洗膜后滴加超敏發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）顯影。采用Quantity One軟件進(jìn)行分析處理，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值做統(tǒng)計(jì)分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié) 果

1 NaCl與NKABRS對(duì)細(xì)胞活力的影響

各濃度的NaCl處理NRK-52E細(xì)胞后，CCK-8結(jié)果表明，0.25 mol/L、0.35 mol/L和0.45 mol/L NaCl組在藥物作用12和24 h后細(xì)胞活力下降（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。計(jì)算24 h的NaCl中位致死劑量（LD50）約為0.25 mol/L，因此選擇0.25 mol/L作為后續(xù)研究中高濃度NaCl的實(shí)驗(yàn)濃度。

分別采用3%、5%、7%和9%濃度的Control-S和NKABRS處理細(xì)胞后，CCK-8結(jié)果表明，與相同濃度的Control-S組相比，3%和5%NKABRS處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力提高（P＜0.01），且3%NKABRS組細(xì)胞活力顯著高于5%NKABRS組（P＜0.05），見(jiàn)圖1B。因此選擇3%為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中NKABRS的實(shí)驗(yàn)濃度。

Figure 1.Effects of NaCl and NKABRSon cell viability.A：effects of different concentration of NaCl on cell viability；B：effects of different concentration of NKABRSon cell viability.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs3%Control-S group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs5%Control-Sgroup；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs7%Control-Sgroup；$$P＜0.01 vs9%Control-Sgroup.圖1 NaCl與NKABRS對(duì)細(xì)胞活力的影響

2 NKABRS和高濃度NaCl對(duì)細(xì)胞內(nèi)OPN表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

光鏡下觀察細(xì)胞顯示，control組和NKABRS組細(xì)胞呈扁平不規(guī)則的多角形；NaCl組細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，細(xì)胞間連接減少，大部分細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離，皺縮懸浮于培養(yǎng)液中；與NaCl組相比，NaCl+NKABRS組的細(xì)胞皺縮脫離顯著減少，見(jiàn)圖2A。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，與control組相比，各組細(xì)胞凋亡率均增加（P＜0.05）；與NKABRS組相比，NaCl組及NaCl+NKABRS組的細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01）；與NaCl組相比，NaCl+NKABRS組的細(xì)胞凋亡率減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2B、C。CCK-8結(jié)果表明，與control組相比，NKABRS組細(xì)胞活力提高（P＜0.05），NaCl組的細(xì)胞活力下降（P＜0.01）；與NKABRS組相比，NaCl組及NaCl+NKABRS組的細(xì)胞活力均下降（P＜0.01）；與NaCl組相比，NaCl+NKABRS組細(xì)胞活力升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2D。

RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明，與control組相比，NKABRS組OPN mRNA和蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），NaCl組和NaCl+NKABRS組OPN mRNA和蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與NKABRS組相比，NaCl組和NaCl+NKABRS組OPN mRNA和蛋白增加（P＜0.01）；與NaCl組相比，NaCl+NKABRS組OPNmRNA和蛋白減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2E。

3 NKABRS和高濃度NaCl對(duì)細(xì)胞內(nèi)CYP27B1、BMP-7、NCC和CLC-5的影響

RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明，與control組相比，NaCl組CYP27B1、BMP-7和CLC-5 mRNA及蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），NCCmRNA和蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與NaCl組 相 比，NaCl+NKABRS組CYP27B1、BMP-7和CLC-5 mRNA及蛋白表達(dá)增加（P＜0.01），NCC mRNA和蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），見(jiàn)圖3A、B。免疫熒光結(jié)果表明，與control組相比，NaCl組NCC的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，CLC-5的熒光強(qiáng)度減弱（P＜0.01）；與NaCl組相比，NaCl+NKABRS組NCC的熒光強(qiáng)度減弱，CLC-5的CY3熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.01），見(jiàn)圖3C、D。

4 siRNA沉默NCC和CLC-5基因模型構(gòu)建

三種不同濃度（25、50、100 nmol/L）的siRNA（si-NCC 1/2/3和si-CLC-5 1/2/3）對(duì)NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，RT-qPCR結(jié)果表明，與si-NC（NCC/CLC-5）組相比，除25 nmol/L濃度的si-NCC 3組外，其余各組NCC及CLC-5 mRNA表達(dá)均減少（P＜0.01），見(jiàn)圖4。本研究選擇100 nmol/L濃度的si-NCC 1及si-CLC-5 1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

5 沉默NCC和CLC-5基因后NKABRS和高濃度NaCl對(duì)細(xì)胞BMP-7、CYP27B1和OPN表達(dá)的影響

沉默NCC基因后，RT-qPCR結(jié)果表明：與si-NC+0.25 mol/L NaCl組相比，si-NCC+0.25 mol/L NaCl組的OPNmRNA表達(dá)減少（P＜0.01），CYP27B1和BMP-7 mRNA表達(dá)增加（P＜0.01）；與si-NC+0.25 mol/L NaCl+NKABRS組相比，si-NCC+0.25 mol/L NaCl+NKABRS組的CYP27B1和BMP-7 mRNA增加（P＜0.05）；與si-NCC+0.25 mol/L NaCl組相比，si-NCC+0.25 mol/L NaCl+NKABRS組的CYP27B1和BMP-7的mRNA增加（P＜0.01），見(jiàn)圖5A。

前部分研究顯示，control組的細(xì)胞CLC-5表達(dá)高于NaCl（0.25 mol/L）處理組（P＜0.01），見(jiàn)圖3。細(xì)胞CLC-5基因沉默將抑制CLC-5表達(dá)，因此在CLC-5基因沉默后我們予0.11 mol/L NaCl干預(yù)細(xì)胞以嘗試促進(jìn)細(xì)胞CLC-5的表達(dá)增加，進(jìn)而觀察CLC-5和NKABRS對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。沉默CLC-5基因后，RTqPCR結(jié)果表明：與si-NC+0.11 mol/L NaCl組相比，si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl組的OPN mRNA表達(dá)增加（P＜0.01）；與si-NC+0.11 mol/L NaCl+NKABRS組相比，si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl+NKABRS組的OPN mRNA表達(dá)增加（P＜0.01）；與si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl組相比，si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl+NKABRS組的OPN mRNA表達(dá)減少（P＜0.01）。與si-NC+0.11 mol/L NaCl組相比，si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl組的CYP27B1和BMP-7 mRNA表達(dá)減少（P＜0.01）；與si-NC+0.11 mol/L NaCl+NKABRS組相比，si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl+NKABRS組的CYP27B1和BMP-7 mRNA表達(dá)減少（P＜0.01）；與si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl組相比，si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl+NKABRS組的CYP27B1和BMP-7 mRNA表達(dá)增加（P＜0.01），見(jiàn)圖5B。

討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，高鹽攝入可以影響骨代謝，減少骨量和骨密度，與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“咸入腎，腎主骨，過(guò)咸傷骨”理論相符合，但具體分子機(jī)制尚未完全闡明?，F(xiàn)代學(xué)者對(duì)腎藏象理論中腎和骨的聯(lián)系也進(jìn)行了總結(jié)與描述，研究顯示與腎臟相關(guān)的作用于骨骼的細(xì)胞因子中，腎小管內(nèi)的BMP-7和骨化三醇參與不同階段的骨形成、重塑和修復(fù)，在骨代謝中起著至關(guān)重要的作用［16-17］。高鹽飲食引起的高尿鈣排泄被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵誘因之一，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腎小管內(nèi)的NCC和CLC-5通過(guò)對(duì)鈉、氯離子的調(diào)節(jié)而影響尿鈣排泄，與骨代謝密切相關(guān)［4-6］。因此腎小管內(nèi)的影響骨代謝的細(xì)胞因子及離子通路可能是探索“咸入腎，腎主骨，過(guò)咸傷骨”理論的途徑之一。

Figure 2.Effects of NKABRSand high concentration of NaCl on the OPN expression and cell viability and apoptosis of NRK-52E cells.A：the microscopic images showed that the cells in the control group and the NKABRSgroup were irregular polygons（Scale bar=100μm），the cells in the NaCl group were long and spindle shaped，the connection between cells reduced，and most cells shrunk and were suspended in the culture solution，the cells shrinkage and shedding of the NaCl+NKABRS group was significantly reduced，compared with the NaCl group；Band C：the apoptosis of cultured NRK-52Ecells was determined by flow cytometry；D：effects of NKABRSand high concentration of NaCl on cell viability；E：the expression of OPN mRNA and protein.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs NKABRSgroup；△△P＜0.01 vs NaCl group.圖2 NKABRS和高濃度NaCl對(duì)細(xì)胞OPN mRNA、蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3.Effects of NKABRSand high concentration of NaCl on the mRNA and protein expression of CYP27B1，BMP-7，NCCand CLC-5 in NRK-52E cells.A：the protein expressions of CYP27B1，BMP-7，NCCand CLC-5；B：the mRNA expressions of CYP27B1，BMP-7，NCCand CLC-5；Cand D：the distribution of NCCand CLC-5 protein was determined by immunofluorescence（Scale bar=50μm）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs NaCl group.圖3 NKABRS和高濃度NaCl對(duì)細(xì)胞CYP27B1、BMP-7、NCC和CLC-5 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.Relative mRNA expression of NCCand CLC-5 after transfection.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs the siRNA NCgroup.圖4轉(zhuǎn)染后細(xì)胞NCC和CLC-5 mRNA的表達(dá)變化

Figure 5.Effects of NKABRSand high concentration of NaCl on the mRNA expression of BMP-7，CYP27B1 and OPN after NCC（A）and CLC-5（B）gene silencing in NRK-52Ecells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs NaCl group；▲▲P＜0.01 vs si-NCC+0.25 mol/L NaCl group；△△P＜0.01 vs si-NC+NaCl+NKABRSgroup；@@P＜0.01 vs si-CLC-5+0.11 mol/L NaCl group.圖5 沉默NCC和CLC-5基因后NKABRS和高濃度NaCl對(duì)細(xì)胞BMP-7、CYP27B1和OPN mRNA表達(dá)的影響

腎小管上皮細(xì)胞的健康和正常表型對(duì)于尿鈣排泄十分重要，鈣穩(wěn)態(tài)可能會(huì)受到腎臟損傷的嚴(yán)重影響［18］。腎臟中的OPN蛋白是腎小管上皮細(xì)胞的生存因子和腎小管間質(zhì)損傷的早期標(biāo)志物［19］。本研究顯示高濃度（0.25 mol/L）NaCl可增加體外NRK-52E細(xì)胞的OPN表達(dá)，并降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而NKABRS可顯著抑制高濃度NaCl作用下OPN的表達(dá)水平，提高細(xì)胞活力并減少細(xì)胞凋亡率，表明高濃度NaCl可以損傷體外NRK-52E細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡，而NKABRS可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。關(guān)于高鹽對(duì)腎臟的損傷作用，研究顯示高鹽飲食對(duì)腎臟具有血流動(dòng)力學(xué)改變之外的獨(dú)立損害作用［20-22］，其中腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）導(dǎo)致的腎纖維化對(duì)腎損害影響尤為顯著［22］。OPN亦是腎纖維化的啟動(dòng)因子［23］，而B(niǎo)MP-7除了是骨骼生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)因子，還是維持腎小管上皮細(xì)胞正常表型的重要調(diào)節(jié)因子［24］。在各種急性腎損傷或慢性腎纖維化動(dòng)物模型中BMP-7的表達(dá)均顯著降低，且BMP-7的升高還可抑制EMT［25-26］。此外有研究報(bào)道CLC-5可能是治療腎纖維化的新型治療靶標(biāo)，體外的人腎小管上皮細(xì)胞和小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)的CLC-5過(guò)表達(dá)可以阻止EMT［27］。本研究顯示，高濃度NaCl可抑制體外NRK-52E細(xì)胞BMP-7和CLC-5的表達(dá)，而NKABRS可部分阻抑高濃度NaCl對(duì)細(xì)胞BMP-7和CLC-5表達(dá)的影響。且本研究中高濃度NaCl處理體外NRK-52E細(xì)胞后，細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)錘形且細(xì)胞間連接減少，這與腎小管上皮細(xì)胞的EMT形態(tài)一致，而NKABRS可部分抑制細(xì)胞骨架的改變。以上結(jié)果表明，高濃度NaCl可誘導(dǎo)體外NRK-52E細(xì)胞損傷，并可能誘導(dǎo)或加劇EMT進(jìn)程，而NKABRS可抑制NRK-52E細(xì)胞的損傷及EMT進(jìn)程。

BMP-7和1-α羥化酶被認(rèn)為是“腎主骨”理論的物質(zhì)基礎(chǔ)［16-17］，二者對(duì)骨密度的增加起著關(guān)鍵作用。機(jī)體發(fā)育所必須的BMP-7主要由腎臟合成［20］，在外髓質(zhì)小管中表達(dá)最高［28］，并通過(guò)血液循環(huán)以激素樣方式作用于遠(yuǎn)處骨組織［29］。1α-羥化酶主要存在于腎近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)，是骨化三醇羥化的關(guān)鍵酶［30］，由CYP27B1基因編碼［31］。體內(nèi)的維生素D必須被1α-羥化酶羥化才可合成骨化三醇并具有調(diào)節(jié)骨代謝的生理作用［32］。本研究顯示，高濃度NaCl可抑制體外NRK-52E細(xì)胞BMP-7和1α-羥化酶的表達(dá)，而NKABRS可顯著提升高濃度NaCl作用下的BMP-7和1α-羥化酶水平。BMP-7和1α-羥化酶主要在腎小管中表達(dá)，二者在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)減少將導(dǎo)致其在機(jī)體中的表達(dá)量相應(yīng)減少。本研究提示，高鹽可能通過(guò)下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)BMP-7及1α-羥化酶水平而抑制機(jī)體內(nèi)其二者對(duì)骨密度的正向調(diào)節(jié)作用，而NKABRS可能通過(guò)提高腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的BMP-7和1α-羥化酶水平發(fā)揮對(duì)骨密度的保護(hù)作用。此外本研究中，高濃度NaCl亦影響了體外NRK-52E細(xì)胞內(nèi)的離子通路NCC和CLC-5。NCC具有同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)鈉、氯離子的功能，在腎小管中負(fù)責(zé)鈉鈣離子的重吸收，參與調(diào)節(jié)機(jī)體骨礦化及尿鈣排泄［4，33］，而CLC-5參與氯離子的重吸收并影響尿鈣排泄［6，34］。本研究顯示，高濃度NaCl可增加體外NRK-52E細(xì)胞內(nèi)NCC水平并降低CLC-5水平，而NKABRS可顯著抑制高濃度NaCl所誘導(dǎo)的NCC過(guò)表達(dá)并升高CLC-5水平。現(xiàn)已明確NCC過(guò)表達(dá)或抑制CLC-5可導(dǎo)致機(jī)體尿鈣排泄增加，而為了維持血鈣濃度機(jī)體將釋放骨鈣，最終導(dǎo)致骨密度降低。以上結(jié)果提示，高濃度NaCl可能通過(guò)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NCC過(guò)表達(dá)并抑制CLC-5表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體尿鈣排泄增加進(jìn)而影響骨密度，NKABRS可能通過(guò)抑制NCC過(guò)表達(dá)并上調(diào)CLC-5表達(dá)從而防治高鹽飲食所引起的骨密度減少。

為了進(jìn)一步探究NKABRS作用下NCC和CLC-5在腎小管上皮細(xì)胞高鹽損傷中的作用以及與BMP-7、1α-羥化酶之間的關(guān)系，本研究在體外NRK-52E細(xì)胞內(nèi)敲減了NCC和CLC-5基因。本研究證實(shí)抑制NCC可抑制高濃度NaCl所誘導(dǎo)的OPN高表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)高濃度NaCl誘導(dǎo)的BMP-7和1α-羥化酶低表達(dá)，而NKABRS可進(jìn)一步上調(diào)1α-羥化酶和BMP-7表達(dá)。抑制CLC-5可增加OPN表達(dá)并降低BMP-7和1α-羥化酶的表達(dá)水平，而NKABRS可抑制OPN表達(dá)并上調(diào)BMP-7和1α-羥化酶的表達(dá)水平。1α-羥化酶表達(dá)水平的降低與前期研究［35-36］中CLC-5基因敲除小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，但與一部分動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反［37-38］，有研究認(rèn)為這是由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中尿鈣的提高刺激腸道鈣吸收而間接導(dǎo)致的［39］。因此，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中CLC-5對(duì)1α-羥化酶的調(diào)節(jié)作用可能有所差異，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證明高濃度NaCl可通過(guò)誘導(dǎo)體外NRK-52E細(xì)胞的NCC過(guò)表達(dá)并下調(diào)CLC-5表達(dá)以調(diào)節(jié)OPN、BMP-7和1α-羥化酶表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷并加速EMT進(jìn)程，而腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)骨代謝相關(guān)因子的表達(dá)減少在機(jī)體中可能會(huì)導(dǎo)致骨密度降低；NKABRS可通過(guò)抑制NCC和OPN表達(dá)并上調(diào)CLC-5、BMP-7和1α-羥化酶表達(dá)對(duì)高濃度NaCl作用下的體外NRK-52E細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。這為高鹽通過(guò)腎小管上皮細(xì)胞影響骨密度的作用機(jī)制以及NKABRS在其中的防治作用提供了參考資料。