劉培培，馮趙慧子，嚴金玲，曾雪亮，潘靜，高暢

1.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000；2.贛州市人民醫(yī)院，江西 贛州 341000

乳腺癌是產生于乳腺和導管中的惡性腫瘤，是女性最常見的腫瘤。近年來，乳腺癌的發(fā)病率逐漸上升，對女性健康有很大的威脅［1-2］。乳腺癌細胞的遠處轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因；乳腺癌侵襲轉移的防治是目前乳腺癌的主要靶點和困難之一。目前，對乳腺癌轉移的治療沒有明顯的突破，主要用手術治療、化療來防止復發(fā)轉移，然而，化療具有強烈的毒性，有時甚至加速腫瘤的復發(fā)和遠距離轉移。因此，尋找一種既能預防癌癥復發(fā)轉移，又能減少放化療毒副作用的抗癌藥物迫在眉睫。銀杏是新生代第四紀冰川期的殘遺植物。世界上超過70%的銀杏樹在我國生長。EGb-761 是從名貴中藥銀杏葉中提取的有效活性成分，主要用于治療認知障礙、血管疾病、腫瘤等等［3-6］。但關于其對乳腺癌實體瘤影響作用的研究和乳腺癌轉移的作用尚未見報道，因此本文旨在研究EGb-761 是否對乳腺癌肺轉移型小鼠體內實體瘤有影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選取8 周齡健康清潔級雌性BALB/c 小鼠40只，購自重慶醫(yī)科大學動物實驗中心［生產許可證號：SYXK（渝）2002007］，自適應喂養(yǎng)1 周后開始試驗。將小鼠隨機分為五組，即正常組、模型組、EGb-761 組［高劑量組（200 mg/kg）、中劑量組（100 mg/kg）、低劑量組（50 mg/kg）］，每組8 只。

1.2 實驗材料

取銀杏葉粉碎，加乙醇在70 ℃左右的環(huán)境中浸提；再加入用酸調節(jié)后的乙醇，過濾、沉淀濃縮液稀釋冷卻至-1 ℃～20 ℃沉降；上清液用苯乙烯形大孔吸附樹脂柱吸附，然后洗脫；洗脫液通過DAD-1 吸附，以提取酸樹脂柱；流出液和洗脫液濃縮干燥，以備用。

1.3 實驗儀器

銀杏葉（當?shù)刂兴幍辏?、乙醇（上海生工生物工程股份有限公司）、苯乙烯（Sigma-Aldrich 公司）、培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）、FBS 緩沖液（Becton-Dickinson 公司）、游標卡尺（南京智睿生物科技有限公司）、天平（海天美天平儀器有限公司）、福爾馬林溶液（北京百諾威生物科技有限公司）、解剖顯微鏡（德國Zeiss 公司）、EP 管、離心管（美國Corning 公司）、異丙醇（北京索萊寶科技有限公司）、離心機（北京白洋離心機有限責任公司）

1.4 方法

1.4.1造模于BALB/c 小鼠第二對乳房右側皮下接種為 2×105個/只的4T1 乳腺癌細胞，體積約0.1 mL/只，接種前混勻細胞懸液，于4 ℃條件下1 h內完成。移植腫瘤細胞后的第7 天開始，觸診每只造模小鼠注射細胞區(qū)域，以判斷原位腫瘤是否產生,小鼠飼養(yǎng)約30 d 后即可造成乳腺癌肺轉移，每日稱量小鼠體質量并記錄。

1.4.2觀察并測量各組小鼠原位灶實體瘤體積和小鼠體質量各實驗組在注射4T1 細胞24 h 后,計算實體瘤體積：每周用游標卡尺測量實體瘤的長、寬，并計算實體瘤體積（cm3）=（長×寬2）/2；計算實體瘤質量/小鼠體質量：取處死后的小鼠原發(fā)灶腫瘤，用天平稱取實體瘤重，并計算小鼠體質量。

1.4.3觀察并計算各組小鼠肺部轉移灶結節(jié)數(shù)、轉移率摘取各組小鼠肺部組織，將其放入福爾馬林溶液中浸泡 1 個月后，在解剖顯微鏡下觀察并計算其表面腫瘤轉移結節(jié)數(shù)。轉移率=模型組中已轉移的動物數(shù)量（只）/模型組動物總數(shù)（只）×100%

1.4.4RT-PCR 法檢測各組小鼠CK-19 mRNA 表達將肺組織研磨后將組織轉移到EP 管；然后，在4 ℃下，以12 000 g 的速率離心15 min，得到上清液；然后加入異丙醇0.7 mL，混勻，室溫10 min；加1.4 mL 75%乙醇混勻；4 ℃，7 000 g 離心5 min，丟棄，在室溫下干燥5 min；DEPC 處理滅菌純水100 μL 溶解，-80 ℃保存，然后進行逆轉錄反應。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0 軟件。計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠原位灶實體瘤體積和小鼠體質量比較

各組小鼠原位灶實體瘤體積和小鼠體質量比較結果見表1，EGb-761 低、中、高劑量組實體瘤體積均低于模型組，且隨著EGb-761 劑量的增加，體積越來越?。籈Gb-761 低和中、高劑量組的體質量均高于模型組，隨著EGb-761 劑量的增加，實驗組小鼠體質量呈增加趨勢，與模型組比較，中、高劑量組體質量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠原位灶實體瘤體積和小鼠體質量比較（）

表1 各組小鼠原位灶實體瘤體積和小鼠體質量比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

2.2 各組小鼠肺部轉移灶結節(jié)數(shù)、轉移率比較

各組小鼠肺部轉移灶結節(jié)數(shù)和轉移率比較結果如表2，EGb-761 低、中、高劑量組結節(jié)數(shù)均低于模型組，且隨著EGb-761 劑量的增加，肺部結節(jié)數(shù)也隨之減少，與模型組比較，各劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而隨著EGb-761 劑量的增加，肺轉移率隨之降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺部轉移灶結節(jié)數(shù)和肺轉移率比較（）

表2 各組小鼠肺部轉移灶結節(jié)數(shù)和肺轉移率比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

2.3 各組小鼠CK-19mRNA 表達比較

各組小鼠CK-19mRNA 表達比較結果見表3，EGb-761 低、中、高劑量組分別低于模型組，且隨著EGb-761 劑量的增加，各劑量組小鼠肺CK-19 mRNA 表達量越低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠CK-19mRNA表達比較（）

表3 各組小鼠CK-19mRNA表達比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

3 討論

EGb-761 的提取工藝已非常成熟，國際上常以德國生產工藝為參照標準。銀杏葉提取物含有黃酮類化合物、烯醇類、酚類、糖類等活性成分，國內外均有研究表明EGb-761 具有顯著抗腫瘤作用［7-8］，其中關于抗乳腺癌作用方面亦有報道［9-10］。乳腺癌細胞轉移過程可以大致分為三個階段:附著力、入侵和遷移。在體內研究中發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤向淋巴道和肺組織轉移多見，如乳腺癌則常向同側腋窩淋巴結或肺部轉移，造成原發(fā)灶與轉移灶均有腫瘤或結節(jié)產生。4T1 細胞是一類從BALB/c 小鼠乳腺癌細胞中分離出的細胞系，其在小鼠乳房皮下移植后，可形成腫瘤由原位自發(fā)地轉移至肺、肝、骨髓等器官，因此，實驗研究時一般采用BALB/c 小鼠乳腺癌 4T1 高轉移細胞株造成乳腺癌轉移模型。

在本研究中，EGb-761 低中高劑量組的體瘤體積均低于模型組，而小鼠體質量均高于模型組，說明造模成功；各組小鼠肺部轉移灶結節(jié)數(shù)和轉移率結果表明，隨著EGb-761 劑量的增加，肺部結節(jié)數(shù)隨之減少，肺部轉移率隨之降低。這說明，EGb-761 對乳腺癌肺轉移有抑制作用。有研究證實，由于CK-l9 在上皮細胞膜上表達，可以作為上皮細胞的標志物，因此它在上皮起源的惡性腫瘤的早期血型轉移或微小轉移研究中運用較多。肺部惡性腫瘤無論是鱗癌還是腺癌均起源于肺泡上皮細胞，其CK-l9 均有廣泛表達，所以在肺癌患者的血中檢測CK-l9mRNA 或CK-l9 蛋白的表達可以監(jiān)測和評估是否存在潛在的肺癌轉移風險或腫瘤有無復發(fā)［11］。在本次實驗中發(fā)現(xiàn)，EGb-761 低、中、高劑量組的CK-19mRNA 表達量均低于模型組，且隨著EGb-761 劑量的增加，CK-19mRNA 表達量越低。因此推測，EGb-761 可能通過影響CK-19mRNA 表達來抑制乳腺癌的轉移。

綜上所述，推測銀杏葉提取物（EGb-761）可能通過影響CK-19mRNA 表達對乳腺癌肺轉移型小鼠體內實體瘤有抑制作用，其機制可能是通過抗血管生成來實現(xiàn)的。這為抑制乳腺癌轉移提供了新的研究思路。