陸夢瑩, 蘇冒亮, 張俊彬,2

1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306;

2. 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點實驗室, 深圳大學(xué)生命科學(xué)與海洋學(xué)院, 廣東 深圳 518060;

3. 光電子器件與系統(tǒng)教育部和廣東省重點實驗室, 深圳大學(xué)光電工程學(xué)院, 廣東 深圳 518060

鹽度作為水體重要環(huán)境因素之一, 對水生生物的生命生理活動具有重要影響(Jeffries et al, 2019)。海水的蒸發(fā)降雨、洋流運動、及全球變暖引起的冰川融化使得近幾年近岸海水鹽度的變化越來越劇烈(Chesney et al, 2000; Nielsen et al, 2012; Duggan et al,2014; Van Wijk et al, 2014)。環(huán)境鹽度發(fā)生變化時,魚體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)將會發(fā)生改變, 進一步影響其正常的生理機制和機體免疫能力(Geven et al, 2017;El-Leithy et al, 2019)。長期以來, 人們一直認為環(huán)境條件的改變可能會抑制魚體免疫力, 從而對魚類機體健康有害, 然而也有一些學(xué)者持有不同的觀點,認為環(huán)境條件改變在魚類受到病原的感染其他環(huán)境脅迫時似乎能夠增強免疫力減輕機體受到的損傷(Dhabhar, 2002)。例如: 已有文獻證實鹽度能夠提高免疫相關(guān)基因(IgM、HSP70 等)的表達來影響魚類機體免疫能力(Deane et al, 2004; Huang et al, 2015)。此外, 有研究表明鹽度的升高能夠增強動物上皮細胞對某些病原體的黏附作用, 使病原體更易進入并感染機體, 增強機體吞噬效率, 同時增加涉及先天免疫和炎癥幾種途徑的蛋白豐度, 進而增強機體清除病原體的能力, 增強魚體免疫力(Piertney et al, 2006;Schmitz et al, 2017)。因此, 本文將要探究鹽度變化對于金錢魚免疫系統(tǒng)應(yīng)對細菌感染的影響。

細菌廣泛分布在自然水體中, 常常是導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖物種爆發(fā)疾病的重要病原體之一(Laith et al,2014)。近年來, 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)爆發(fā)了大量的細菌性疾病, 對養(yǎng)殖業(yè)造成了不可估量的損失(Van Hai,2015)。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年魚類爆發(fā)的細菌性疾病中常見致病菌之一, 多被用作科學(xué)研究中進行動物感染實驗的病原(Zhang et al,2016; Abdelhamed et al, 2017; Baumgartner et al,2017; Peatman et al, 2018)。Altinok 等(2001)發(fā)現(xiàn)斑點叉尾鮰、金魚、條紋鱸魚和墨西哥灣鱘在面對柱狀黃桿菌感染時, 死亡率隨著鹽度上升所導(dǎo)致的細菌體外粘附力下降而降低。但嗜水氣單胞菌對魚體免疫狀態(tài)受鹽度影響的研究尚少, 與鹽度相互作用的規(guī)律尚不明確。因此, 本文將采用嗜水氣單胞菌進行動物感染實驗以便分析比較魚類免疫學(xué)狀態(tài)。

金錢魚(Scatophagus argus)隸屬于鱸形目金錢魚屬金錢魚科, 是一種廣鹽性硬骨魚類, 主要分布在印度—太平洋沿岸(Bardach et al, 1972; Ghazilou et al, 2011)。在我國主要生活在江河入?？诘南痰蝗谒蚪r礁處。金錢魚常常在初春時節(jié)游至近岸產(chǎn)卵, 產(chǎn)卵后的成魚游向外海, 而幼魚則在近岸沿海巖礁區(qū)覓食生長, 隨著幼魚的生長發(fā)育成熟逐漸遷徙至遠岸海水區(qū), 直至性成熟再回到近岸進行下一輪產(chǎn)卵活動(梁雪梅, 2018)。就其生活史來看,金錢魚具有典型的生殖洄游習(xí)性, 在其完整的生長周期中必定會經(jīng)歷海水不同的鹽度變化, 生活鹽度范圍從5‰～30‰不等(Mookkan et al, 2014)。由于金錢魚對鹽度擁有較強的耐受性, 抗逆能力強, 在我國東南沿海地區(qū)又極受人們的喜愛, 近年來人們開始將金錢魚經(jīng)淡水馴化后進行大規(guī)模的淡水化養(yǎng)殖(楊尉 等, 2018)。因此鹽度在金錢魚生活史中是必不可少的重要環(huán)境因子。

魚類機體中存在多種免疫相關(guān)成分, 它們能夠在魚類受到環(huán)境因素和病原體的影響時保護機體,起到一定的免疫作用。例如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)能夠防止由于鹽度變化引起機體活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生對 機 體 造 成 的 損 傷(Martínez-álvarez et al, 2002;Regoli et al, 2014)。補體Complement 4(C4)(Boshra et al, 2006)、細胞因子Interleukin-6(IL-6)(Dannevig et al,1994; Brattgjerd et al, 1996)和抗體Immunoglobulin M(IgM)(De Lima et al, 2011; Gallani et al, 2019)能夠通過單獨或聯(lián)合作用一起殺死并清除機體中入侵的病原體, 在機體應(yīng)對病原微生物的感染時起到重要的防御作用。腎臟組織作為主要的免疫器官, 存在大量能夠吞噬細菌、釋放免疫相關(guān)分子并促進抗體產(chǎn)生的巨噬細胞(MacArthur et al, 1983; Dannevig et al, 1994; Brattgjerd et al, 1996)。在非特異性免疫、清除碎片和損傷細胞等方面, 腎臟組織也起著重要的作用(Meseguer et al, 1995)。因此, 本文將利用嗜水氣單胞菌進行動物感染實驗, 通過比較不同鹽度組金錢魚血清和腎臟組織中SOD 濃度以及免疫相關(guān)成分C4、IL-6 和IgM 濃度變化來分析鹽度變化對于感染嗜水氣單胞菌時金錢魚血清和腎臟免疫學(xué)功能的影響。這為金錢魚最佳養(yǎng)殖鹽度提供了科學(xué)的參考, 也對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有著重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

健康金錢魚200±50g 購自廣東省湛江市某養(yǎng)殖場, 體長約13±0.5cm, 于自然水體鹽度25‰鹽度水系統(tǒng)中暫養(yǎng)一周后將其分別轉(zhuǎn)至0‰、10‰和25‰鹽度水體中分別馴化, 增氧機增氧, 水溫維持在28±1℃。早晚各投喂一次紅蟲, 實驗開始前三天停止喂食, 馴化兩周后開始實驗。普通肉湯培養(yǎng)基購自上海生工, 補體C4 含量檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司, SOD、IL-6 和IgM 含量檢測試劑盒購自Cusabio 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將嗜水氣單胞菌接種至普通肉湯培養(yǎng)基, 置于28℃恒溫搖床培養(yǎng)18～24h, 將培養(yǎng)所得菌液置于離心機中以4000rpm 離心10min, 收集沉淀。用0.85%無菌生理鹽水將其制成菌懸液, 參考張慶華 等(2016)的實驗方法稀釋成 3×105、3×106、3×107、3×108、3×109、3×1010CFU·mL-L共6 個濃度, 腹腔注射6 組, 每組12 尾魚, 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定注射劑量為每尾0.2mL, 對照組注射等劑量0.85%無菌生理鹽水。實驗魚分組養(yǎng)在不同水箱中, 實驗中連續(xù)充氧, 水溫控制在28±1℃。連續(xù)觀察96h 內(nèi)金錢魚死亡情況, 記錄數(shù)據(jù)并根據(jù)結(jié)果計算LD50。

1.2.2 動物感染實驗

根據(jù)上述LD50 實驗結(jié)果, 確定動物感染實驗注射濃度。重新制備新鮮3×108CFU·mL-1菌懸液, 腹腔注射0‰、10‰和25‰實驗組金錢魚, 每尾注射3×108CFU·mL-1細菌懸液0.2mL, 60 尾每組。對照組5 尾每組, 注射等劑量0.85%無菌生理鹽水。實驗魚分組養(yǎng)在不同水箱中, 在感染后的6、12、24、48、96h 對實驗組進行取樣, 對照組于0h 取樣, 每次每組取樣5 尾。用MS-222 麻醉后解剖, 尾柄取血收集血液, 置于4℃靜置8h, 7000rpm 離心 10min, 收集血清, 將5 份樣本均等隨機混樣成三份, 得到3個生物學(xué)平行樣本, 置于-20℃保存待檢測。每尾魚剪取腎臟組織后于2mL 離心管稱重并按照1∶19 的比例加入無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)后, 置于-20℃冷凍保存。

1.2.3 組織懸液制備

將存放于-20℃冰箱的組織樣品取出, 經(jīng)過反復(fù)兩次凍融后, 在離心管中加入勻漿鋼珠。將每個樣品管簡單配平放置于勻漿容器中, 設(shè)置勻漿條件為60Hz, 每次20s, 勻漿3 次左右。取出樣品, 置于離心機中1000×g 離心5min, 收集上清液。按照血清混樣規(guī)律, 將每個鹽度組, 每個時間點的5 份樣本混樣成3 份生物學(xué)平行樣本

1.2.4 超氧化物歧化酶濃度檢測

超氧化物歧化酶含量檢測試劑盒購自武漢華美生物有限公司, 按照試劑盒說明書檢測血清及腎臟組織中SOD 濃度, 單位為ng·mL-1。取適量血清樣品經(jīng)200 倍稀釋后得到110μL 待測樣品稀釋液備用,吸取110μL 組織樣品原液置于冰臺待檢測。按照說明書指示逐級稀釋標準品得到標準品工作液。每個樣品及標準品分別設(shè)置兩個重復(fù)孔作為技術(shù)平行,按照試劑盒說明書操作步驟進行操作, 加入反應(yīng)終止液后利用酶標儀在450nm 處檢測吸光度。

1.2.5 C4、IL-6 和Ig M 濃度檢測

根據(jù)武漢華美生物公司C4、IL-6 和Ig M 試劑盒說明書對血清和腎臟組織中各免疫相關(guān)指標濃度進行檢測, C4 和Ig M 濃度單位為μg·mL-1, IL-6 濃度單位為pg·mL-1。血清4 倍稀釋, 組織液使用原液進行酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)用EXCEL 軟件進行計算, 結(jié)果以平均值±標準誤(mean±SE)表示。用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA), P＜0.05 表示差異顯著。利用Curve Expert 擬合標準曲線, 將樣品吸光度代入標準曲線得到樣品濃度, 運用 Origin 8.5.0 軟件對數(shù)據(jù)進行圖標的繪制。

2 結(jié)果

2.1 血清和腎臟組織SOD 濃度

血清SOD 濃度結(jié)果顯示(圖1a): 除25‰鹽度組經(jīng)嗜水氣單胞菌注射后第96h 外, 三個鹽度實驗組其他時間點血清 SOD 濃度分別為 989.4±57.8、897.0±32.2 和849.7±23.5ng·mL-1, 均低于對照組。在淡水組中金錢魚經(jīng)嗜水氣單胞菌注射后96h 內(nèi)血清SOD 濃度均低于對照組但差異不顯著; 在低鹽組中金錢魚經(jīng)嗜水氣單胞菌注射后96h 內(nèi)血清SOD 濃度 均 低 于 對 照 組(897.0±32.2ng·mL-1), 在 注 射 后6h(739.2±6.8ng·mL-1)和12h(743.1±3.5ng·mL-1)差異極顯著, 至24～96h 內(nèi)濃度稍有升高; 在25‰鹽度組中除注射后 96h(1182.9±13.1ng·mL-1)高于對照組(849.7±23.5ng·mL-1)外, 其余時間點均顯著低于對照組。與此同時, 除注射后6h 和96h 外, 淡水組和低鹽組血清SOD 濃度均高于25‰鹽度組。

圖1 不同鹽度金錢魚注射嗜水氣單胞菌后96h 內(nèi)血清(a)和腎臟(b)組織中SOD 濃度(n=5)**P ＜ 0.01; * P ＜ 0.05(與對照組相比較)Fig.1 Concentrations of SOD in serum (a) and kidney (b) among three salinity experimental groups after A. hydrophila injection at 6, 12, 24, 48, and 96 h (n=5). **P ＜ 0.01; *P ＜ 0.05 (compared to the control group)

腎臟組織中SOD 濃度結(jié)果顯示(圖1b), 除25‰鹽度組第6h(81.6±0.6ng·mL-1)外, 三個實驗組金錢魚經(jīng)嗜水氣單胞菌注射后腎臟組織SOD 濃度均高于對照組, 分別為 61.9±0.9、84.9±4.0 和 90.8±0.7ng·mL-1, 且于注射后24h 開始與對照組差異極顯著。淡水組和低鹽組腎臟組織SOD 濃度均高于25‰鹽度組, 與血清結(jié)果基本一致。

2.2 血清和腎臟組織C4 濃度

不同鹽度下金錢魚注射嗜水氣單胞菌后血清C4濃度顯示(圖2a), 淡水組血清C4 含量顯著高于對照組(537.5±25.0μg·mL-1), 且呈現(xiàn)上升趨勢。低鹽組和25‰鹽度組血清C4 濃度均在注射后12h 達到最低值,分別為370.3±16.4 和197.3±13.6μg·mL-1; 而后升高,直至96h 時濃度達到523.8±27.9 和507.6±27.2μg·mL-1,均回升至近似對照組(分別為 440.7±28.1 和554.3±18.2·mL-1)水平。淡水組和低鹽組血清C4 濃度趨勢雖不同, 但濃度均高于25‰鹽度組。

腎臟組織中C4 濃度結(jié)果如圖2b 所示, 腎臟組織中C4 濃度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢, 且淡水組與低鹽組濃度均高于25‰鹽度組。其中, 淡水組與低鹽組差異極顯著, 均于注射后24h 達到最高值,分別為218.3±1.2 和186.3±6.0μg·mL-1, 于96h 降至99.6±3.2 和 70.3±5.9μg·mL-1, 接 近 對 照 組 水 平(58.3±0.8 和74.3±1.1μg·mL-1)。25‰鹽度組在注射后6h 的C4 濃度為63.1±0.7μg·mL-1, 在12h 為81.2±3.6μg·mL-1, 顯著低于對照組(95.6±2.1μg·mL-1); 后期呈增加趨勢, 于 48h 達到最大值(119.9±1.5μg·mL-1)后下降。

圖2 不同鹽度金錢魚注射嗜水氣單胞菌后96h 內(nèi)血清(a)和腎臟(b)中C4 濃度變化(n=5)**P ＜ 0.01; * P ＜ 0.05(與對照組相比較)Fig. 2 Concentrations of C4 in serum (a) and kidney (b) among three salinity experimental groups after A. hydrophila injection at 6, 12, 24, 48, and 96 h (n=5). **P ＜ 0.01; *0.01 ＜ P ＜ 0.05 (compared to the control group)

2.3 血清和腎臟組織IL-6 濃度

不同鹽度下金錢魚注射嗜水氣單胞菌后血清IL-6 濃度結(jié)果如圖3a 所示, 淡水組血清IL-6 濃度顯著高于低鹽組和25‰鹽度組。淡水組金錢魚注射嗜水氣單胞菌后血清IL-6 濃度顯著升高, 在注射后12h 達到峰值(56.9±1.0pg·mL-1), 之后呈現(xiàn)下降趨勢,于96h 達到43.5±0.7pg·mL-1, 與對照組水平(42.1±0.5pg·mL-1)相似。淡水組血清IL-6 濃度相比對照組波動不大, 但 25‰鹽度組血清 IL-6 濃度(38.8±1.0pg·mL-1)顯著低于對照組。

腎臟組織中IL-6 濃度如圖3b 所示, 25‰鹽度組與對照組濃度均高于淡水組和低鹽組與兩鹽度對照組濃度。在淡水組中, 金錢魚經(jīng)嗜水氣單胞菌注射后 96h 內(nèi)腎臟組織中 IL-6 濃度低于對照組濃度(15.9±0.2pg·mL-1), 且差異極顯著; 在10‰和25‰鹽度組中, 金錢魚經(jīng)嗜水氣單胞菌注射后第6h 的腎臟組織IL-6 濃度為17.9 和17.9pg·mL-1, 顯著高于對照組(17.3±0.1 和17.1±0.1pg·mL-1); 但從12h(15.3±0.2 和15.5pg·mL-1)開始至48h 三個鹽度組均顯著低于對照組, 且呈上升趨勢。

圖3 不同鹽度金錢魚注射嗜水氣單胞菌后96h 內(nèi)血清和腎臟中IL-6 濃度變化(n=5)**P ＜ 0.01; *P ＜ 0.05(與對照組相比較)Fig. 3 Concentrations of IL-6 in serum (a) and kidney (b) among three salinity experimental groups after A. hydrophila injection at 6, 12, 24, 48, and 96 h (n=5). **P ＜ 0.01; * P ＜ 0.05 (compared to the control group)

2.4 血清和腎臟組織IgM 濃度

不同鹽度組金錢魚經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后血清免疫球蛋白IgM 濃度結(jié)果如圖4a 所示, 三個鹽度組血清IgM 濃度均呈現(xiàn)上升趨勢, 但25‰鹽度組血清IgM 濃度顯著高于淡水組和低鹽組, 同時低鹽組血清IgM 濃度高于淡水組。

不同鹽度實驗組金錢魚腎臟組織中免疫球蛋白IgM 濃度在嗜水氣單胞菌注射后96h 內(nèi)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(圖4b)。其中25‰鹽度組腎臟IgM濃度高于淡水組和低鹽組, 且25‰鹽度組金錢魚腎臟組織中IgM 濃度在注射后12h 達到最大值(6.3±0.4μg·mL-1), 而淡水組和低鹽組晚于且低于25‰鹽度組, 在24h 和48h 才達到最大值, 分別為5.2±0.4和4.9±0.0μg·mL-1(圖4b)。

圖4 不同鹽度金錢魚注射嗜水氣單胞菌后96h 內(nèi)血清(a)和腎臟(b)中IgM 濃度變化(n=5)**P ＜ 0.01; *P ＜ 0.05(與對照組相比較)Fig. 4 Concentrations of IgM in serum (a) and kidney (b) among three salinity experimental groups after A. hydrophila injection at 6, 12, 24, 48, and 96 h (n=5). **P ＜ 0.01; * P ＜ 0.05 (compared to the control group)

3 討論

由于近幾年全球變暖等氣候問題日漸嚴重, 造成了大量的冰川融化以及氣候降水等問題, 致使近岸海水鹽度劇烈波動(Nielsen et al, 2012; Duggan et al, 2014; Van Wijk et al, 2014)。鹽度是影響水生生物生命活動的重要環(huán)境因子, 不僅影響魚類機體滲透調(diào)節(jié), 還能間接影響魚類機體免疫功能(Geven et al,2017; El-Leithy et al, 2019)。腎臟是硬骨魚類重要的免疫器官之一, 其狀態(tài)與魚類機體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)(Guo et al, 2017)。腎臟中免疫相關(guān)因子主要有特異性免疫和非特異性兩大類, 這些免疫相關(guān)因子的含量是檢測其應(yīng)對病原入侵時免疫狀態(tài)的重要指標(Magnadottir et al, 2005; Ni et al, 2016)。在目前的研究中常以SOD、C4 及IL-6 含量等非特異性免疫指標(Whyte, 2007; Zhu et al, 2013; Rombout et al, 2014)和IgM 含量等特異性免疫指標(Larrieta et al, 2012;Rombout et al, 2014)來反映機體免疫狀態(tài)。因此本文以生活在近岸海水交匯區(qū)的金錢魚為研究對象, 以嗜水氣單胞菌為感染病原, 結(jié)合上述免疫指標的檢測結(jié)果, 來研究海水鹽度變化對魚類血清和腎臟免疫狀態(tài)的影響。

眾所周知, 鹽度變化引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)與ROS 的產(chǎn)生有關(guān)(Liu et al, 2007; Lushchak, 2011)。SOD 是抗氧化防御系統(tǒng)中第一個遇到超氧陰離子自由基的抗氧化酶, 能通過直接或間接的機制與非酶自由基清除劑共同作用來避免 ROS 造成的損傷(Regoli et al, 2014; Ghanavatinasab et al, 2019)。因此,SOD 在鹽度與魚類機體的氧化應(yīng)激關(guān)系中起著十分重要的作用, 能夠直接反映魚類受到鹽度脅迫后機體應(yīng)激反映強弱, 可作為評判機體免疫能力的重要指標。在目前已發(fā)表的文章中, 學(xué)者們普遍證實鹽度降低將會導(dǎo)致SOD 活性升高, 以中和鹽度脅迫造成的損傷(An et al, 2010a, b; Zeng et al, 2017)。本實驗觀察到, 除96hpi 外, 血液和腎臟組織中, 淡水組和低鹽組金錢魚體內(nèi)SOD 濃度總體均比25‰鹽度組高約 2～150ng·mL-1, 其中血清結(jié)果差異極顯著(P＜0.01)。由于淡水組和低鹽組金錢魚機體血清及腎臟組織SOD 濃度大量升高, 推測大量 SOD 的激活是由于外界刺激造成的損傷較嚴重, 需要大量SOD來修復(fù)損傷(Zeng et al, 2017)。因此, 相比25‰鹽度組, 淡水組和低鹽組中的金錢魚在受到感染后魚體損傷較重, 腎臟組織免疫狀態(tài)也將隨之降低。

補體C4 在補體系統(tǒng)的三種激活途徑中起關(guān)鍵作用(Sirotkina et al, 2013)。病原體入侵機體時, 補體通過識別蛋白與病原體結(jié)合將會促進巨噬細胞吞噬作用, 并進一步促進細胞因子的釋放和抗體的產(chǎn)生(Boshra et al, 2006; Gallani et al, 2019)。此外, 病原體被三種補體激活途徑的特異性識別分子識別結(jié)合后將會激活C4, 而C4 進一步裂解能夠促進抗體的形成來殺死病原體(Mortensen et al, 2015)。本文通過比較三個鹽度組血清和腎臟組織C4 濃度, 發(fā)現(xiàn)淡水組與低鹽組金錢魚血清和腎臟組織C4 濃度總體均比25‰鹽度組高100～600μg·mL-1(P＜0.01)左右,且淡水組和低鹽組C4 水平均呈現(xiàn)先顯著上升后緩慢下降的趨勢, 25‰鹽度組在血清和腎臟中的C4 水平分別為38.6±1.0 和95.6±2.1μg·mL-1(P＜0.01), 顯著低于對照組, 后期才緩慢上升。以往的研究表明,草魚幼魚C4 含量的增加, 能夠促進其他免疫相關(guān)指標的增加, 共同作用提高機體免疫功能(Liu et al,2018)。但在本實驗中, 淡水組和低鹽組顯著提高了血清和腎臟中C4 濃度, 卻并未顯著激活下游抗體IgM 的產(chǎn)生。由于C4 作為補體激活途徑中關(guān)鍵成分,關(guān)系到吞噬細胞對免疫因子和抗體的釋放和促進作用, 推測是由于淡水組和低鹽組金錢魚補體激活途徑的上游未受到抑制, 促進了C4 的激活, 但C4 未能成功裂解導(dǎo)致下游細胞因子和抗體激活效率或活性下降(Legendre et al, 2017)。因此, 淡水組和低鹽組的補體裂解效率可能受到了抑制, 阻礙了免疫應(yīng)答的進程。

IL-6 是一種多效性細胞因子, 在免疫系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用(Hunter et al,2015)。IL-6 主要是由單核細胞/巨噬細胞受微生物刺激后產(chǎn)生的一種細胞因子(Zou et al, 2016)。在病毒或細菌入侵的過程中, 上述補體C4 促進了吞噬細胞的吞噬和細胞因子的釋放, IL-6 迅速而短暫地上調(diào), 成為感染的重要標志(Narazaki et al, 2018)。在哺乳動物中, IL-6 在感染和組織發(fā)生損傷時迅速產(chǎn)生, 參與宿主防御機制(Rose-John, 2018)。硬骨魚類中, IL-6 被證實參與感染后抗體的產(chǎn)生(Wei et al,2018)。此外, IL-6 能夠促進魚類吞噬細胞的吞噬作用, 提高殺菌活性(Zhu et al, 2019)。在本實驗中雖然三個鹽度感染嗜水氣單胞菌后組腎臟組織IL-6 濃度顯著低于對照組(1 4.2±0.0、1 7.9±0.0 和17.9±0.0pg·mL-1)(P＜0.01), 25‰鹽度組腎臟組織IL-6 水平仍顯著高于淡水組和低鹽組(P＜0.01)。推測低鹽馴化組金錢魚體內(nèi)吞噬細胞對細菌的吞噬作用或吞噬活性低于25‰鹽度組, 低鹽馴化可能會降低金錢魚腎臟組織吞噬細胞對病原的清除率, 降低免疫狀態(tài)。然而, 血清結(jié)果與腎臟存在些許差異, 淡水組的血清 I L-6 濃度在 9 6 h p i 內(nèi)顯著增加至56.9±1.0pg·mL-1(P＜0.01), 但腎臟組織中IL-6 濃度卻低于對照組(15.9±0.2pg·mL-1), 且差異極顯著(P＜0.01)。這可能是由于金錢魚受到感染后, 外周血單核細胞開始產(chǎn)生IL-6 用于清除病菌, 但不能成功轉(zhuǎn)運至腎臟組織, 導(dǎo)致腎臟組織中IL-6 濃度顯著降低(Inturri et al, 2017)。

血清免疫球蛋白是體液免疫系統(tǒng)的主要組成部分, IgM 是魚體內(nèi)存在的主要免疫球蛋白(Wilson et al, 1995)。在機體遭遇抗原的刺激下, 漿細胞產(chǎn)生具有免疫功能的抗體IgM 等免疫球蛋白, IgM 能夠識別和中和體外入侵的病毒和細菌(Cerezuela et al,2012; 張媛媛 等, 2018)。IgM 是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體, 抗體產(chǎn)生量的多少不僅與C4含量與裂解量相關(guān), 同時還與細胞因子的促進作用相關(guān)(侯月娥 等, 2010; Legendre et al, 2017)。IgM 濃度的增加, 能夠促進羅非魚自身免疫系統(tǒng)的聯(lián)級反應(yīng), 增強機體免疫功能(Tellez-Ba?uelos et al, 2010)。本文研究結(jié)果顯示, 25‰鹽度組金錢魚血清和腎臟組織IgM 濃度(71.8±2.9 和6.3±0.4μg·mL-1)比淡水組和低鹽組高約1～20μg·mL-1, 且差異顯著(P＜0.05)。同時, 25‰鹽度組血清和腎臟組織大量產(chǎn)生抗體IgM 時間(12 hpi)早于淡水組和低鹽組(24hpi)。根據(jù)Domingueza 等(2004)和何杰 等(2014)等的研究結(jié)果顯示, 短期的應(yīng)急刺激可能有助于增加循環(huán)蛋白,導(dǎo)致IgM 水平呈現(xiàn)出上升趨勢, 但是隨著應(yīng)激時間的延長, 蛋白開始用于能量需求導(dǎo)致合成減少, 抑制機體免疫活性。因此, 推測本實驗中淡水組和低鹽組血清和腎臟IgM 濃度低于25‰鹽度組的原因可能是由于為期兩周的低鹽馴化導(dǎo)致金錢魚IgM 合成減少, 使機體免疫狀態(tài)受到抑制。綜合上述免疫相關(guān)指標(C4、IL-6 和IgM)的結(jié)果與SOD 結(jié)果, 證實了低鹽馴化導(dǎo)致金錢魚血清和腎臟組織免疫狀態(tài)和功能受到抑制。

本研究通過ELISA 檢測等方法, 比較了不同鹽度條件下血清和腎臟組織SOD 濃度以及免疫相關(guān)指標(C4、IL-6 和IgM)濃度。結(jié)果表明, 淡水組與低鹽組免疫狀態(tài)與25‰鹽度組相比較弱。因此, 我們推測金錢魚在低鹽狀態(tài)下血清和腎臟組織的免疫功能將會減弱或受到抑制, 使得細菌更易感染魚體并造成更嚴重的損傷。綜上所述, 我們建議在金錢魚淡水化養(yǎng)殖中能夠維持一定鹽度, 保護金錢魚腎臟組織免疫機能以避免疾病的發(fā)生。同時, 盡量減少露天養(yǎng)殖, 以避免降雨對池塘鹽度造成的影響, 或者在暴雨過后適當添加海鹽來增加水體鹽度, 以減輕降水導(dǎo)致的水體鹽度波動對金錢魚的影響。