歐冠標(biāo)，周雨晴，彭 昊，陸澤寧，廖玉英，馬東鑫，袁敬知，葛 強(qiáng)，李 珣，王曉曄

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530000；3.南寧市武鳴區(qū)雙橋鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西南寧 530104）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一種重要的條件性致病菌，常寄生于人和動(dòng)物的腸道和呼吸道內(nèi)，可引起肺炎、腦膜炎、腹膜炎、泌尿系統(tǒng)感染、子宮炎、乳房炎及其他化膿性炎癥，甚至敗血癥[1-2]。目前已從馬、牛、豬、雞、鷓鴣、鴨和魚等多種動(dòng)物體內(nèi)分離到Kp[3-7]。各年齡階段的人均可被Kp感染，免疫缺陷者不但易感且易發(fā)敗血癥。Kp廣泛存在于自然界的土、水、谷類中?；颊吆突疾?dòng)物是其主要傳染源，主要通過呼吸道傳播。畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中，家禽及其產(chǎn)品如蛋、肉用雞及它們所處的環(huán)境，可能是人感染Kp的傳染源。普通公眾感染主要是自身帶菌所致的內(nèi)源性感染，少部分是外源性感染，如醫(yī)療器械、靜脈注射等的侵入性診療措施和醫(yī)務(wù)人員帶菌傳播。人食物中毒主要通過被Kp污染的食物。

目前，我國對(duì)Kp的研究大多在人醫(yī)方面，而對(duì)豬源Kp的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)對(duì)從廣東省佛山市一家屠宰場(chǎng)采集的125份肛拭子和50份豬肉樣品，通過細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)、耐藥基因及毒力基因檢測(cè)，探究屠宰前后豬源Kp的分布及相關(guān)菌株的生物學(xué)特性和耐藥性，以期為防控該菌引起的養(yǎng)殖場(chǎng)生豬感染、抗生素耐藥性及保障豬肉品質(zhì)，強(qiáng)化屠宰加工過程中的公共衛(wèi)生管理提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1肛棉拭子 分3批采集自佛山市某屠宰場(chǎng)存欄待宰生豬。采用消毒棉拭子插入生豬肛門采取糞便，置入裝有少量滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，并對(duì)每管標(biāo)記編號(hào)，4 ℃保存，共125份。樣品對(duì)應(yīng)生豬分別來自9個(gè)省份，其中福建12份、廣東38份、湖南25份、江西28份、吉林8份、遼寧4份、陜西6份、山西2份、黑龍江2份。

1.1.2豬肉樣品 采集自該屠宰場(chǎng)屠宰后流水線上的生豬胴體。用滅菌剪子剪取約1 cm×1 cm的肉粒一塊，每份肉樣裝入滅菌離心管內(nèi)，-20 ℃存儲(chǔ)，共50份。樣品對(duì)應(yīng)生豬來自6個(gè)省份，其中福建8份、江西8份、黑龍江5份、廣東12份、遼寧6份、湖南11份。上述肛棉拭子和豬肉采樣后做好記錄，包括日期、編號(hào)、產(chǎn)地等，然后將樣品冷凍保存送往廣西大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.1.3主要試劑 麥康凱（MAC）培養(yǎng)基、Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基，均購自O(shè)xoid公司；藥敏試驗(yàn)抗菌素藥粉，購自北京索萊寶科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker、2×RapidTaqMaster Mix聚合酶，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；革蘭氏染色液，購自北京索萊寶科技有限公司；試驗(yàn)所用引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng) 將采集的樣品解凍后，于無菌環(huán)境下用接種環(huán)蘸取管內(nèi)液體，劃線接種于MAC培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～16 h；挑取大小一致、粉紅色黏液性的單個(gè)疑似菌落接種于MAC培養(yǎng)基進(jìn)行純化，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察；最后接種單個(gè)菌落于3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.216S rRNA及體外溶血酵素基因（khe）擴(kuò)增鑒定

1.2.2.116S rRNA細(xì)菌分離純化后提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，用16S rRNA基因序列通用引物（上游引物：5'-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3'；下游引物：5'-GTTGGCGGACGGGTGAGTAA-3'）進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增片段長度約1 500 bp，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：上、下游引物各1.0 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，DNA模板2.0 μL，最后ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè) 循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證擴(kuò)增條帶。將目的條帶切膠回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將分離株16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2.2khe基因khe基因僅存在于Kp，可作為鑒定的特異性靶標(biāo)[8]。根據(jù)GenBank中khe基因序列（登錄號(hào)：CP035202.1）設(shè)計(jì)特異性引物（khe-F：5'-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3'；khe-R：5'-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為489 bp，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系與16S rRNA擴(kuò)增體系相同。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3毒力基因擴(kuò)增 以細(xì)菌基因組DNA為模板，對(duì)fimH、kfu、aereobactin、wabG、uge等5種毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物信息見表1）和凝膠電泳分析，比較不同來源菌株毒力基因分布。

表1 毒力基因引物序列信息

1.2.4耐藥基因擴(kuò)增 以細(xì)菌基因組DNA為模板，對(duì)氨基糖苷類耐藥基因aadA1、aadB，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaOXA，喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-Ib-cr，四環(huán)素類耐藥基因tet(A)，酰胺醇類耐藥基因floR以及硫酸粘桿菌素耐藥基因mcr-1等進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物詳情見表2）和凝膠電泳分析，比較不同來源菌株耐藥基因分布。

表2 耐藥基因引物序列信息

1.2.5藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）文件（M100-S21）推薦的微量肉湯稀釋法，對(duì)分離得到的Kp采用9類12種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥物均購自O(shè)xoid公司。12種藥物分別是，慶大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）、美羅培南（MEM）、阿莫西林/克拉維酸鉀（AMC）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢吡肟（FEP）、頭孢西丁（FOX）、環(huán)丙沙星（CIP）、氯霉素（CHL）、硫酸粘桿菌素（COL）、四環(huán)素（TET）、磷霉素（FOS）。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其耐藥性。同時(shí)，比較分析不同地區(qū)Kp耐藥情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察

分離純化后，在MAC瓊脂平板上呈現(xiàn)粉紅色、中央凸起、表面光滑、大小一致的黏液狀菌落（圖1-A）；用接種環(huán)蘸取菌落，隨后向上提起，部分菌落拉動(dòng)成絲；挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察可見單個(gè)、成雙或鏈狀排列的短粗狀革蘭氏陰性菌（圖1-B）。

圖1 MAC瓊脂平板上的紅色菌落及革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（100×）

2.2 16S rRNA擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，部分產(chǎn)物擴(kuò)增出大小約1 540 bp的片段（圖2），與預(yù)期目的片段大小相同。取16S rRNA PCR產(chǎn)物測(cè)序分析，將此基因序列與NCBI GenBank中已有序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性在99%以上。

圖2 分離菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 khe 基因擴(kuò)增

部分菌株khe基因擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由圖3可知，擴(kuò)增條帶約489 bp，與預(yù)期目的條帶大小一致。

圖3 khe 基因擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.4 各地區(qū)樣品檢測(cè)情況

經(jīng)16S rRNA、khe基因擴(kuò)增，從125份肛棉拭子樣品、50份宰后生豬肉類樣品中各分離得到32、4株Kp。按采樣日期順序命名為GDKP-1～36（GDKP-1～32分離自肛棉拭子樣品，GDKP-33～36分離自豬肉樣品）。

由表3可知，在肛棉拭子樣品中，共檢測(cè)出32株Kp，涵蓋7個(gè)省份，分別為福建（4株，GDKP-6/GDKP-7/GDKP-30/GDKP-31）、廣東（8株，GDKP-4/GDKP-5/GDKP-8/GDKP-9/GDKP-14/GDKP-21/GDKP-2 2/G D K P-2 3）、湖南（6株，GDKP-2/GDKP-3/GDKP-11/GDKP-12/GDKP-13/GDKP-20）、江 西（9株，GDKP-1/GDKP-10/GDKP-15/GDKP-18/GDKP-19/GDKP-24/GDKP-25/GDKP-26/GDKP-32）、吉 林（2株，GDKP-16/GDKP-17）、遼寧（1株，GDKP-29）、陜西（2株，GDKP27/GDKP-28）；豬肉樣品中，有3個(gè)省份檢出4株Kp，分別為江西2株（GDKP-33/GDKP-34）、黑龍江1株（GDKP-35）、福建1株（GDKP-36）。

表3 各地區(qū)樣品檢測(cè)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.5 耐藥基因以及毒力基因擴(kuò)增與分析

從耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果（表4）來看，36株Kp含耐藥基因比例從大到小依次為tet(A)（83.3%）、floR（63.9%）、mcr-1（27.8%）、aadA1（11.1%）、blaTEM、blaOXA和qnrB（均為8.3%）、aac(6')-Ib-cr（5.6%）、blaCTX-M-1（2.8%），其他耐藥基因無檢出；從毒力基因檢測(cè)結(jié)果（表4）來看，比例從大到小依次為wabG（72.2%）、fimH和uge（均為69.4%）、kfu（63.9%）、aereobactin（19.4%）。耐藥基因中，同時(shí)攜帶floR+tet(A)的菌株最多，達(dá)23株（占63.9%）；毒力基因中，同時(shí)攜帶kfu+fimH+uge+wabG的菌株最多，達(dá)20株（占55.6%）。詳細(xì)基因型分布見表4和圖4。

表4 不同地區(qū)肺炎克雷伯氏菌株耐藥基因和毒力基因分布

圖4 36株肺炎克雷伯氏菌耐藥基因和毒力基因分布

2.6 藥敏試驗(yàn)

2.6.1耐藥性分析 對(duì)分離到的36株Kp進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表5。由表5可知，36株Kp對(duì)各種抗生素的耐藥率介于0～83.3%。其中對(duì)TET耐藥率最高，為83.3%；對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率依次是CHL（63.9%）＞COL（27.8%）＞GEN（11.1%）＞FOX/CIP（8.3%）＞AMC（5.6%）＞CTX（2.8%）。分離株對(duì)AMK、MEM、FEP、FOS的耐藥率均為0，敏感性相當(dāng)高。從抗生素大類來看，耐藥率依次是四環(huán)素類（83.3%）＞酰胺醇類（63.9%）＞多肽類（27.8%）＞喹諾酮類（8.3%）＞氨基糖苷類（0～11.1%）＞β-內(nèi)酰胺類（0～8.3%）＞碳青霉烯類和其他（0）。

表5 分離株耐藥數(shù)據(jù)分析結(jié)果

2.6.2耐藥性區(qū)域分布 不同地區(qū)Kp耐藥性結(jié)果（表6）顯 示：36株Kp中有6株耐受4種抗生素，耐藥譜和菌株來源分別為GDKP-6/GDKP-7（FOX+CHL+COL+TET）來源于福建，GDKP-9（AMC+CIP+CHL+TET）和GDKP-23（AMC+FOX+CHL+TET）來源于廣東，GDKP-11（GEN+CIP+CHL+TET）和GDKP-13（CTX+CIP+CHL+TET）來源于湖南；有6株耐受3種抗生素，耐藥譜和菌株來源分別為GDKP-8（GEN+CHL+TET）來 源于廣東，GDKP-24（GEN+CHL+TET）和GDKP-18/GDKP-19/GDKP-26（CHL+COL+TET）來源于江西，GDKP-29（CHL+COL+TET）來源于遼寧；有13株耐受2種抗生素，耐藥譜和菌株來源分別為CHL+TET（江西5株：GDKP-1/GDKP-10/GDKP-15/GDKP-25/GDKP-33；湖南2株：GDKP-2/GDKP-3；廣東2株：GDKP-4/GDKP-22；福建1株：GDKP-31；黑龍江1株：GDKP-35）、GEN+TET（陜西1株：GDKP-28）、COL+TET（江西1株：GDKP-32）；有8株耐受1種抗生素，耐藥譜和來源分別為TET（廣東2株：GDKP-5/GDKP-21；陜西1株：GDKP-27；福建1株：GDKP-30；江西1株：GDKP-34）、COL（廣東1株：GDKP-14；湖南1株：GDKP-20；福建1株：GDKP-36）；有3株不耐受藥物，分別為湖南1株（GDKP-12）、吉林2株（GDKP-16/GDKP-17）。

表6 不同地區(qū)Kp耐藥情況分布 單位：株

3 討論

Kp是醫(yī)院獲得性感染及社區(qū)獲得性感染中常見的條件致病菌，在由革蘭氏陰性菌引起的血流感染中，其分離率僅次于大腸埃希菌[21]。近年來，Kp已成為最重要的條件致病菌之一，并且耐藥性逐漸增強(qiáng)[22]。長期以來，人醫(yī)臨床領(lǐng)域?qū)υ摼叨戎匾?，但是?dòng)物源Kp并未受到廣泛關(guān)注，關(guān)于豬源Kp的報(bào)道較少。本試驗(yàn)從某屠宰場(chǎng)待宰生豬125份肛拭子樣品和50份宰后豬肉樣品中共分離得到36株Kp，檢出率為20.57%（36/175），檢出率較高。杜琳等[23]對(duì)我國部分地區(qū)奶牛乳房炎進(jìn)行分離鑒定，從497份樣本中分離得到46株Kp，分離率為9.26%；張聰?shù)萚24]對(duì)南寧市伴侶動(dòng)物源Kp檢測(cè)結(jié)果顯示，犬、貓的分離率分別為5.26%（3/57）、2.44%（1/41）。楊帆等[25]對(duì)醫(yī)源與動(dòng)物源Kp耐藥性分析發(fā)現(xiàn)：醫(yī)源菌株耐藥率顯著高于動(dòng)物源菌株；在動(dòng)物源菌株中，雞源和豬源菌株耐藥率高于兔源和犬源菌株；除犬源菌株外均表現(xiàn)多重耐藥。綜上，不同動(dòng)物源Kp檢出率以豬較高，這可能與我國生豬養(yǎng)殖規(guī)模大、數(shù)量多，生產(chǎn)過程常使用抗生素來促進(jìn)生長和預(yù)防疾病有關(guān)，而牛和犬接觸抗生素的概率相對(duì)較少，所以牛源、犬源菌株耐藥率較低。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，36株Kp對(duì)AMK、MEM、FEP和FOS耐藥率均為0，表明分離菌株對(duì)這4種藥物非常敏感。分離菌株對(duì)TET、CHL耐藥率（分別為83.3%和63.9%）較高，對(duì)頭孢菌素類、青霉素類、氨基糖苷類和喹諾酮類等受試藥物耐藥性并不嚴(yán)重，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與養(yǎng)殖期間生豬用藥狀態(tài)有關(guān)。在使用抗生素時(shí)，一些新合成的、價(jià)格昂貴的藥物，很少在動(dòng)物中使用，故對(duì)其產(chǎn)生的耐藥性較低，如MEM、FEP、FOS等藥物在動(dòng)物中使用可能較少。

多黏菌素被認(rèn)為是治療耐碳青霉烯Kp感染聯(lián)合抗菌療法的主要抗生素。一些菌株通過脂多糖修飾多黏菌素耐藥性，并且這些耐多黏菌素分離株的分離頻率逐漸增加[26]。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，硫酸粘桿菌素耐藥基因mcr-1檢出率為27.8%（10/36），與張聰?shù)萚24]報(bào)道的mcr-1檢出率呈上升趨勢(shì)結(jié)論一致。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extendedspectrum β-lactamase，ESBL）是目前已知的細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制[26]，本試驗(yàn)中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCTX-M-1、blaOXA檢出率分別為8.3%、2.8%、8.3%，與細(xì)菌耐藥表型一致。

毒力基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與脂多糖合成的毒力因子wabG攜帶率（72.2%）最高，其次另一個(gè)與脂多糖合成相關(guān)的毒力基因uge攜帶率（69.4%）也超過60%，表明分離菌株攜帶脂多糖相關(guān)毒力因子概率較高。脂多糖通過補(bǔ)體介導(dǎo)所形成的連鎖反應(yīng)，在菌體表面聚集成復(fù)合物，從而介導(dǎo)細(xì)菌逃避或抵抗宿主天然免疫的殺傷[9]。黏附素是細(xì)菌傳播定殖的關(guān)鍵因素，檢測(cè)結(jié)果顯示黏附素相關(guān)毒力因子fimH和kfu攜帶率（分別為69.4%和63.9%）均超過60%，并且4株來源于宰后豬肉的分離株均攜帶fimH和kfu，表明攜帶黏附素毒力因子更易造成細(xì)菌傳播。

有研究[27]顯示，不合理使用抗生素會(huì)促進(jìn)耐藥基因傳播。雖然屠宰場(chǎng)能有效降低出場(chǎng)豬肉細(xì)菌攜帶率，但不能完全阻斷耐藥基因傳播。因此，科學(xué)選擇抗生素，交替使用不同類型抗菌藥物，避免耐藥性產(chǎn)生對(duì)于阻止細(xì)菌耐藥性擴(kuò)散極為重要。此外，屠宰場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)屠宰加工環(huán)節(jié)管理，嚴(yán)格執(zhí)行加工過程中各項(xiàng)規(guī)章制度并規(guī)范操作，提高工作人員自身素質(zhì)和安全衛(wèi)生意識(shí)，降低細(xì)菌交叉污染的可能性，確保豬肉品質(zhì)安全以降低細(xì)菌病發(fā)生，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。

本研究共分離到36株Kp，分離菌株對(duì)頭孢菌素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和喹諾酮類等受試藥物表現(xiàn)敏感，而對(duì)四環(huán)素類、酰氨醇類和多肽類等藥物耐藥性較高，尤其以TET和CHL較為嚴(yán)重。共檢測(cè)出9種耐藥基因：tet(A)、floR、mcr-1、aadA1、blaTEM、blaCTX-M-1、blaOXA、qnrB和aac(6')-Ib-cr；檢測(cè)出5種毒力基因：wabG、fimH、uge、kfu和aereobactin。本研究表明，應(yīng)交替使用不同類型抗菌藥物，最大程度避免細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。同時(shí)，屠宰場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)管理，提高安全衛(wèi)生意識(shí)，降低細(xì)菌交叉污染，保障豬肉品質(zhì)衛(wèi)生。