吳錢弟，吳茗花，沈 毅，王 西，羅愛民

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065；2.四川郎酒股份有限公司，四川古藺 646523）

“曲乃酒之骨”[1]，大曲在白酒釀造過程中發(fā)揮著不可替代的作用。大曲不僅為白酒釀造提供豐富的微生物系和酶系，啟動(dòng)白酒的發(fā)酵過程，同時(shí)也為白酒帶來多種香氣成分[2-3]。

四甲基吡嗪是一種具有烘烤、甜香味的化合物[4]，也是白酒中的一種重要香氣成分[5]。在日本納豆[6]、發(fā)酵的可可豆中均能分離到四甲基吡嗪[7]，四甲基吡嗪賦予這些發(fā)酵食品重要的香氣。除此之外，由于其對(duì)高血脂、高膽固醇的治療作用，可預(yù)防心血管疾病等生理藥理作用[8-9]，近年來，在健康白酒的大環(huán)境下，四甲基吡嗪已被廣泛研究[10-11]。江南大學(xué)通過現(xiàn)代風(fēng)味化學(xué)、微生物學(xué)與代謝工程等科學(xué)理論和先進(jìn)技術(shù)手段確定了中國(guó)白酒中四甲基吡嗪的產(chǎn)生機(jī)制為：功能菌株糖降解產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脫羧產(chǎn)生乙偶姻，發(fā)酵體系中的乙偶姻（Acetoin，ACT）和由氨基酸轉(zhuǎn)化而來的氨經(jīng)過非酶促反應(yīng)生成四甲基吡嗪[12-13]。為探索白酒中四甲基吡嗪的來源，吳建峰[14]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌麩曲是白酒中四甲基吡嗪的主要來源之一。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，提高大曲中的四甲基吡嗪含量有望提高白酒中的吡嗪含量。

大曲的發(fā)酵是一個(gè)開放式的多菌株協(xié)同發(fā)酵過程。在高溫大曲發(fā)酵的前期，霉菌和酵母作為主要優(yōu)勢(shì)微生物，產(chǎn)生多種酶系和香氣成分的前體物質(zhì)為后期高溫發(fā)酵提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。根霉曲已被證明具有較強(qiáng)的糖化力[16]，可促進(jìn)糖酵解作用進(jìn)而推動(dòng)乙偶姻的產(chǎn)生，從而提高四甲基吡嗪的含量。畢赤酵母，除了具有產(chǎn)酒和產(chǎn)香的作用外，還有產(chǎn)酶和多種蛋白的作用[17]。在高溫大曲發(fā)酵后期，溫度達(dá)到40 ℃后，酵母菌已不適應(yīng)其生長(zhǎng)環(huán)境，菌體開始大量死亡變?yōu)樨S富的蛋白資源，提供氮源[18]。本實(shí)驗(yàn)通過芽孢桿菌純種發(fā)酵，芽孢桿菌和酵母菌，芽孢桿菌、酵母菌和霉菌混合發(fā)酵，模擬工廠大曲發(fā)酵過程，提高了曲樣中四甲基吡嗪的含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品及原料：Bacillus licheniformis從高溫大曲中篩得[19]，Pichia kudriavzevii從醬香型白酒酒糟中篩出[20]，均保藏于本研究室；根霉曲，安琪酵母股份有限公司；小麥粉、稻殼，四川郎酒廠。

試劑：四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純），北京譜析-盛世康普；乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純），阿拉丁試劑公司；納氏試劑，成都市科隆化學(xué)品有限公司。甲醇（色譜純）等其他試劑均購(gòu)于四川蜀都試劑公司。

儀器設(shè)備：THZ-98AB恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HWS-150恒溫恒濕試驗(yàn)箱，上海蘇盈試驗(yàn)儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；安捷倫Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），安捷倫科技有限公司；SW-CJ-JD型超凈工作臺(tái)，江蘇凈化設(shè)備有限公司；UV756型紫外分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；JA1203電子天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；TGL-15B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C pH計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；YM-1000CT超聲儀，上海豫明儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基制備

芽孢桿菌種子液培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

酵母菌種子液培養(yǎng)基：酵母膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1000 mL，pH中性，121 ℃滅菌20 min。葡萄糖單獨(dú)115 ℃滅菌15 min。

固態(tài)培養(yǎng)基：小麥粉和稻殼按10∶1的比例混合均勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的蒸餾水，混勻，置于沸水上蒸30 min，蒸至不見生粉狀態(tài)。再裝入250 mL錐形瓶中（每瓶50 g），封口，121 ℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組別：A組：只接種芽孢桿菌；B組：芽孢桿菌與酵母菌同時(shí)接種；C組：先接種酵母菌，再接種芽孢桿菌；D組：先接種酵母菌和根霉曲，再接種芽孢桿菌。

種子液的制備：挑取一小環(huán)菌苔至種子培養(yǎng)基中，芽孢桿菌置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，畢赤酵母置于30 ℃下培養(yǎng)48 h，振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速130 r/min，至OD600nm=2.0左右。

固態(tài)培養(yǎng)：在無菌條件下，待固態(tài)培養(yǎng)基滅菌冷卻至室溫后，A組：接種1 mL芽孢桿菌種子液至培養(yǎng)基中；B組：同時(shí)接種3 mL酵母菌種子液和1 mL芽孢桿菌種子液至培養(yǎng)基中；C組：先接種3 mL酵母菌種子液，發(fā)酵3 d后再接種1 mL芽孢桿菌種子液；D組：先同時(shí)接種3 mL酵母菌種子液和根霉曲粉末0.3 g，發(fā)酵3 d后再接種1 mL芽孢桿菌種子液。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。模擬工廠制曲的溫濕度變化，發(fā)酵條件為：1～2 d，30 ℃，90 %RH；3～4 d，37 ℃，95%RH；5～6 d，45 ℃，95%RH；7 d，55 ℃，95%RH；8 d，65 ℃，95%RH。

1.3.2 四甲基吡嗪和乙偶姻的測(cè)定

樣品制備：稱取樣品10 g，加入無水CaCl20.1 g，60 %vol乙醇30 mL，在25 ℃下超聲處理20 min（100 w，20 KHz），以8000 r/min離心10 min。取上清液過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

四甲基吡嗪色譜條件：流動(dòng)相為甲醇∶超純水（0.05 %三氟乙酸）=7∶3，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

乙偶姻色譜條件：流動(dòng)相為甲醇∶超純水（0.05 %三氟乙酸）=3∶7，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.3 氨含量的測(cè)定

參考弓曉峰[21]的方法稍作修改：稱取樣品2 g，加入蒸餾水20 mL浸泡30 min，隔10 min攪拌1次，8000 r/min離心10 min，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，定容，再加入1 mL酒石酸鉀鈉溶液和1 mL納氏試劑，搖勻，精確反應(yīng)10 min后，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)390 nm處檢測(cè)。用氯化銨作標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 酸度和還原糖的測(cè)定

酸度采用電位滴定法，斐林試劑法測(cè)定還原糖[1]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)均處理3個(gè)重復(fù)，用Excel和Origin（2019b）進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四甲基吡嗪含量比較分析（圖1）

圖1 四組實(shí)驗(yàn)四甲基吡嗪含量比較分析

四組實(shí)驗(yàn)發(fā)酵結(jié)束時(shí)四甲基吡嗪的含量見圖1。由圖1可知，接種霉菌、酵母和芽孢桿菌的D組四甲基吡嗪含量最高，為881.5 μg/g；先后接種酵母和芽孢桿菌的C組四甲基吡嗪較低于D組，為493.9 μg/g；芽孢桿菌純種發(fā)酵的A組四甲基吡嗪含量為293.6 μg/g；然而，同時(shí)接種酵母和芽孢桿菌的B組四甲基吡嗪含量最低，為150.1 μg/g。結(jié)果說明，同時(shí)接種酵母菌和芽孢桿菌會(huì)產(chǎn)生抑制作用[22]，從而影響四甲基吡嗪的生成。D組與C組比較可知，接種霉菌會(huì)較大的促進(jìn)四甲基吡嗪的產(chǎn)生，這可能是由于霉菌在發(fā)酵前期產(chǎn)生了較大的糖化作用，因此提高了四甲基吡嗪的含量。D組和C組混菌發(fā)酵的結(jié)果明顯優(yōu)于A組純種發(fā)酵，因此先后接種的混菌發(fā)酵有利于提高四甲基吡嗪的含量。

2.2 乙偶姻含量分析（圖2）

圖2 各組實(shí)驗(yàn)發(fā)酵乙偶姻含量的分析

四組實(shí)驗(yàn)發(fā)酵結(jié)束的乙偶姻含量見圖2。由圖2可知，C組乙偶姻含量為150.1 mg/g；D組乙偶姻含量略低于C組，為140.4 mg/g，A組和B組乙偶姻含量分別為99.4 mg/g和61.8 mg/g。結(jié)果表明，同時(shí)接種酵母菌和芽孢桿菌會(huì)相互抑制，使乙偶姻的生成量降低。但是，先后接種酵母菌和芽孢桿菌會(huì)促進(jìn)乙偶姻的生成，C組乙偶姻含量為B組的兩倍多。D組乙偶姻含量略低于C組，結(jié)合圖2四甲基吡嗪的分析，可能是由于一部分乙偶姻已轉(zhuǎn)化為四甲基吡嗪。A組純種發(fā)酵乙偶姻的含量較低于C組和D組，表明酵母和霉菌在按先后接種順序培養(yǎng)的條件下可以促進(jìn)乙偶姻的生成，其結(jié)果明顯優(yōu)于純種發(fā)酵。

2.3 氨含量分析（圖3）

圖3 四組實(shí)驗(yàn)發(fā)酵氨含量的分析

四組實(shí)驗(yàn)發(fā)酵結(jié)束時(shí)氨含量的結(jié)果見圖3。氨作為四甲基吡嗪的又一重要前體物質(zhì)，其主要來源于多種氨基酸通過氨基酸脫氫酶的轉(zhuǎn)化[14]。氨含量的變化與乙偶姻相似，C組氨含量為5.7 mg/g，略高于D組5.3 mg/g，A組和B組氨含量分別為4.4 mg/g和3.6 mg/g。結(jié)果表明，先接種酵母菌和霉菌，再接種芽孢桿菌同樣會(huì)促進(jìn)氨的生成，同時(shí)接種反而會(huì)抑制氨的生成。D組氨含量低于C組，原因可能是氨與乙偶姻用于合成四甲基吡嗪，因此氨含量減少。

2.4 還原糖和酸度分析（圖4）

還原糖通過糖酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸通過2-乙酰乳酸聚合酶（ALS）和2-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）作用下生成乙偶姻[12]。由圖4a知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，C組和D組還原糖含量差別不大，D組略高于C組，其中A組和B組還原糖含量較低于C組和D組，且B組還原糖含量低于A組。結(jié)果說明，先后接種酵母菌和霉菌可促進(jìn)還原糖的產(chǎn)生，這與酵母菌和霉菌在發(fā)酵前期的糖化液化的作用有關(guān)[23]。由圖4b知，四組實(shí)驗(yàn)酸度的變化趨勢(shì)與還原糖相似，一定的酸性環(huán)境可促進(jìn)四甲基吡嗪的生成，這與以前的研究結(jié)果類似[24]。

圖4 四組實(shí)驗(yàn)發(fā)酵還原糖（a）和酸度（b）的分析

2.5 乙偶姻、氨、還原糖和酸度對(duì)生成四甲基吡嗪的比較（圖5）

圖5 乙偶姻、氨、還原糖、酸度與四甲基吡嗪之間相關(guān)性分析

運(yùn)用origin計(jì)算出乙偶姻、氨、還原糖、酸度和四甲基吡嗪之間相關(guān)性的大小。由圖5可知，各因素之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.75，說明彼此之間的相關(guān)性均較強(qiáng)。對(duì)四甲基吡嗪而言，酸度、還原糖和乙偶姻對(duì)其影響更大。酸度和還原糖對(duì)乙偶姻、氨的影響也較大。在發(fā)酵前期，霉菌和酵母產(chǎn)生多種酶類，將淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖，霉菌較強(qiáng)的糖化力和液化力有利于前期發(fā)酵過程淀粉的利用，隨著發(fā)酵進(jìn)行，酸性也越來越大，因此在發(fā)酵前期接種酵母菌和霉菌有利于四甲基吡嗪的生成。

3 結(jié)論

本研究通過四組實(shí)驗(yàn)?zāi)M工廠制曲中四甲基吡嗪的產(chǎn)生情況。得出結(jié)論，D組四甲基吡嗪含量最高，為881.5 μg/g，其次是C組和A組，分別為493.9 μg/g和293.6 μg/g，B組四甲基吡嗪含量最低，為150.1 μg/g。乙偶姻和氨的含量變化相似，C組和D組差別不大，且明顯高于A組和B組，其中C組略高于D組，A組較高于B組。C組和D組還原糖含量明顯高于A組和B組，B組還原糖含量最低。C組和D組的酸度也高于A組和B組。四甲基吡嗪在白酒中的產(chǎn)生是通過功能菌株糖酵解、丙酮酸轉(zhuǎn)化等發(fā)酵過程產(chǎn)生乙偶姻，氨基酸通過氨基酸脫氫酶生成氨，乙偶姻和氨再合成四甲基吡嗪。加入糖化力強(qiáng)的根霉曲有利于還原糖的生成，酵母菌在前期發(fā)酵過程會(huì)產(chǎn)生多種酶類，分解原料促進(jìn)前體物質(zhì)的生成，在發(fā)酵溫度升高以后酵母菌體死亡作為氮源促進(jìn)芽孢桿菌等耐熱性細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此，本研究利用大曲發(fā)酵過程中微生物的作用特點(diǎn)，先接種酵母菌和根霉曲，再接種芽孢桿菌可提高大曲中四甲基吡嗪的含量，為多菌株協(xié)同發(fā)酵提高白酒中四甲基吡嗪的含量提供了思路。