姚涵尋　粟暉　溫健　姚志湘

摘 要：利用熒光總體積積分算法，結(jié)合三維熒光光譜技術(shù)，對槐米甲醇提取液中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分析.以蘆丁為對照，以甲醇為提取溶劑，設(shè)置不同時間、溶劑倍量和溫度的條件，分析各條件下槐米甲醇提取液中黃酮類物質(zhì)的提取情況;并在中草藥浸提數(shù)學(xué)模型的基礎(chǔ)上對不同條件下槐米的浸提過程進(jìn)行動力學(xué)驗證.結(jié)果顯示，槐米甲醇提取液中黃酮類物質(zhì)提取的較優(yōu)條件為：熱力學(xué)溫度333 K，時間[≥]80 min，溶劑倍量[≤]100;在浸提動力學(xué)研究中，lnC分別與lnt、ln（M-R）、（1/T）×103成線性關(guān)系，符合中草藥浸提的數(shù)學(xué)模型.

關(guān)鍵詞：槐米;黃酮類物質(zhì);醇提;三維熒光;動力學(xué)

中圖分類號：TQ91;R927.2? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.02.015

0引言

槐米為豆科植物槐的干燥花蕾，具有清肝明目，涼血止血等功效，為常用中藥[1].槐米中含有大量的黃酮類、多糖類、三萜皂苷類及醇類等成分，其中黃酮類含量高達(dá)20%以上，具有清除自由基、抗腫瘤、抗病毒等功效，也是槐米發(fā)揮藥效的主要功能性成分[2-4].黃酮類物質(zhì)不易溶于水，而易溶于醇，因此，用甲醇提取槐米中的黃酮類物質(zhì)比用水提取效果更充分.

三維熒光光譜具有確定的維度優(yōu)勢，相比其他檢測方法，三維熒光光譜法檢測更靈敏，選擇性更高，且取樣容易，樣品用量少，更方便快捷[5-7].研究中草藥浸出過程的動力學(xué)關(guān)系，能夠為有關(guān)中藥提取的實驗提供設(shè)計依據(jù).張衛(wèi)波等[8]通過對絞股藍(lán)中的多糖進(jìn)行提取，建立了多糖的提取動力學(xué)方程;魏小紅等[9]用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇提取芹菜葉中的黃酮，并求得有關(guān)動力學(xué)參數(shù);鄧輝等[10]建立了丹參中的丹酚酸B的提取動力學(xué)方程，使浸提過程的條件選擇更具有科學(xué)性.本文所得到的光譜是黃酮類物質(zhì)的混合光譜，選擇熒光總體積積分算法進(jìn)行計算能夠從整體上將黃酮類物質(zhì)的含量表示出來，避免了其他算法的復(fù)雜性.

本文設(shè)計不同溫度、時間及溶劑倍量3個條件對槐米進(jìn)行提取，分析了槐米甲醇提取液的三維熒光特性，采用熒光總體積積分算法[11]對不同條件下提取的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行定量分析，研究浸提過程中黃酮類物質(zhì)濃度的變化規(guī)律，并以中草藥浸提的數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)，對槐米的浸提過程進(jìn)行動力學(xué)研究.

1實驗方法

1.1?? 儀器和試劑

主要儀器有：同步吸收-三維熒光光譜儀（Aqualog-UV-800-C型，HORIBA集團(tuán)）、電子分析天平（AL104型，上海梅特勒-托利多公司）、智能磁力攪拌器（ZNCL-G190*90型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）.

槐米購于廣西玉林中藥材市場，產(chǎn)地為廣西;蕓香葉苷（98%，上海凜恩科技發(fā)展有限公司）.

1.2?? 槐米中黃酮類物質(zhì)的浸提

在 100 mL甲醇中加入一定量的槐米，水浴回流，磁力攪拌轉(zhuǎn)速450 r/min，在不同條件下進(jìn)行浸提實驗，其中浸提熱力學(xué)溫度為313 K、318 K、323 K、328 K、333 K，時間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，溶劑倍量（溶劑甲醇所需體積與槐米質(zhì)量之比）為100、125、150、175、200.分別取出少量不同條件下的浸提液，稀釋后進(jìn)行三維熒光檢測.

三維熒光檢測條件：激發(fā)波長300～600 nm，積分時間0.5 s，步進(jìn)3 nm.檢測到原始數(shù)據(jù)后，得到系列樣本三維光譜數(shù)據(jù).

1.3?? 熒光總體積積分法定量分析浸提液

熒光總體積積分法是利用Monte-Carlo積分原理對特征物質(zhì)峰進(jìn)行體積積分，進(jìn)而通過積分值來表示物質(zhì)熒光強(qiáng)度的方法[12].熒光總體積積分算法相比于其他算法操作更簡單，只需對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行選擇處理便可進(jìn)行計算，保留了數(shù)據(jù)的原始特點(diǎn)，能更好地體現(xiàn)數(shù)據(jù)的真實性.熒光總體積積分公式[13]如下：

[?=ExEmI（λExλEm）dλExdλEm]? ?（1）

式中：[?]為熒光區(qū)域的積分體積，au·nm2;[λEx]為激發(fā)波長，nm;[λEm]為發(fā)射波長，nm;[I（λExλEm）]為激發(fā)-發(fā)射波長對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，au.

精密稱取蘆丁對照品粉末0.030 0 g于燒杯中，甲醇溶解，配制得到質(zhì)量濃度范圍在20～1 200 μg/mL的對照品溶液.用熒光總體積積分方法計算蘆丁對照品中特征峰的體積積分值，以對照品的濃度為橫坐標(biāo)，熒光體積積分值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.

對各浸提液及對照品的三維熒光光譜進(jìn)行分析，選出樣本及對照品中對應(yīng)黃酮類物質(zhì)的熒光響應(yīng)峰，應(yīng)用式（1），求取各樣本和對照品的總體積積分值.

1.4?? 槐米中黃酮類物質(zhì)的浸出動力學(xué)

儲茂泉等[14-15]在假設(shè)中草藥浸提的速率完全受擴(kuò)散控制的前提下，根據(jù)Fick第一擴(kuò)散定律推導(dǎo)出了中草藥浸提過程中浸出物濃度與時間、溶劑倍量和溫度的數(shù)學(xué)關(guān)系式，分別為：

[lnC=λ+Vlnt]? （2）

[lnC=a-Yln（M-R）]?? （3）

[lnC=X-YT]（4）

其中：[C]為浸出物的質(zhì)量濃度;[t]為浸提時間;[M]為溶劑倍量;[R]為藥材充分吸濕所需的溶劑體積與干藥材質(zhì)量之比，可由實驗得出;[T]為提取熱力學(xué)溫度;[λ]、[V]、[a]、[Y]、[X]均為常數(shù).

分別取一定量的槐米，加入不同體積的甲醇，求取充分吸濕所需甲醇的體積[R].根據(jù)各單因素條件下浸提液中黃酮類物質(zhì)的濃度，分別分析lnC與lnt、ln（M-R）、1/T的關(guān)系.

2結(jié)果和討論

2.1?? 浸提液三維熒光譜圖分析

對照品蘆丁和浸提液樣本的三維熒光光譜圖如圖1所示，蘆丁對照品在[λEx]=430 nm、[λEm]=700 nm，[λEx]=425 nm、[λEm]=725 nm以及[λEx]=430 nm、[λEm]=530 nm處出現(xiàn)了3個主要的熒光峰.樣本的熒光譜圖與對照品相比，只有[λEx]=430 nm、[λEm]=700 nm和 [λEx]=425 nm、[λEm]=725 nm的兩個峰，考慮是由于樣本提取物中物質(zhì)含量復(fù)雜，導(dǎo)致譜圖出峰情況略有差異;或者由于[λEx]=430 nm、[λEm]=700 nm位置的峰強(qiáng)度太高以至于[λEx]=430 nm、[λEm]=530 nm位置的峰沒有顯現(xiàn)出來.根據(jù)對照品及樣本的出峰情況，本文對[λEx]=430 nm、[λEm]=700 nm，[λEx]=425 nm、[λEm]=725 nm和[λEx]=430 nm、[λEm]=530 nm 3個位置的峰進(jìn)行體積積分，得到的積分總和作為評價槐米浸出物多少的標(biāo)準(zhǔn).

2.2?? 熒光總體積積分法定量分析浸提液

2.2.1?? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用熒光總體積積分方法計算蘆丁對照品在20～1 200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的體積積分值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y =22 133x+3×106，相關(guān)系數(shù) r =0.998 7，具有良好的線性關(guān)系.

2.2.2?? 浸提條件下槐米中黃酮類物質(zhì)浸出情況分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得各樣本質(zhì)量濃度，進(jìn)而分析槐米中黃酮類物質(zhì)浸出量與溫度、時間、溶劑倍量的關(guān)系，如圖2所示.

由熱力學(xué)溫度與質(zhì)量濃度的關(guān)系圖（圖2（a））可以看出，相同溶劑倍量條件下，隨著溫度的升高各時間點(diǎn)下的質(zhì)量濃度也成上升趨勢，其中在318～323 K和328～333 K時曲線斜率最大，濃度上升速度最快，在323～328 K時濃度基本無變化，因此，在這個溫度范圍時槐米品質(zhì)成分的浸出經(jīng)歷了一個平臺期.由于甲醇的沸點(diǎn)為337.85 K，所以在不超過沸點(diǎn)溫度的前提下，提取溫度越高，提取效率越高，文中選取333 K為甲醇提取的最適熱力學(xué)溫度.

由時間與質(zhì)量濃度的關(guān)系圖（圖2（b））可以看出，在相同溶劑倍量的前提下，60 min之內(nèi)，各溫度下的質(zhì)量濃度均隨提取時間的增加而增加，說明在本次實驗條件下，1 h的提取時間內(nèi)，槐米中的黃酮類物質(zhì)不會被提取完全.圖3是在333 K浸提條件下黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量濃度與時間的關(guān)系，由圖3可以看出，在80 min左右黃酮類物質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，并保持穩(wěn)定，由此可知，在用甲醇為溶劑從槐米中提取黃酮類物質(zhì)時，提取時間應(yīng)盡量?? [≥]80 min，否則提取效率過低，導(dǎo)致提取不完全.

由溶劑倍量和質(zhì)量濃度的關(guān)系圖（圖2（c））可以看出，相同溫度不同時間點(diǎn)下測得的樣品質(zhì)量濃度均隨溶劑倍量的增加而減小，在溶劑倍量為100～125 時，有效成分濃度下降得最快，因此，在保證提取效率的前提下，槐米提取時的溶劑倍量應(yīng)[≤]100.

2.3?? 槐米品質(zhì)成分浸出動力學(xué)驗證

本實驗首先對槐米充分吸濕所需水的體積進(jìn)行了實驗獲取，得到如表1所示的結(jié)果.對R值求平均為0.54 mL/g.

依據(jù)前文所得實驗數(shù)據(jù)，研究lnC、lnt、ln（M-R）與1/T之間的關(guān)系，得到如圖4所示的提取動力學(xué)關(guān)系圖.

通過槐米浸提的動力學(xué)關(guān)系圖可以看出，lnC與lnt、lnC與ln（M-R）、lnC與（1/T）×103均成線性關(guān)系，說明槐米中黃酮類物質(zhì)的甲醇提取過程符合儲茂泉等[14]提出的中草藥浸提動力學(xué)方程，為實際槐米浸提條件的設(shè)置提供了參考.

3結(jié)論

用三維熒光光譜技術(shù)，結(jié)合熒光總體積積分算法，對槐米中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了甲醇浸提過程的研究和浸提動力學(xué)方程的驗證.得到了槐米浸提的較優(yōu)條件：提取熱力學(xué)溫度為333 K，時間[≥]80 min，溶劑倍量[≤]100.在浸提動力學(xué)研究中，得到了lnC與lnt、ln（M-R）、（1/T）×103的關(guān)系，均符合中草藥浸提的數(shù)學(xué)模型所表示的線性關(guān)系.

通過對槐米醇提液中黃酮類物質(zhì)浸出規(guī)律的研究，找到了浸提過程的較優(yōu)條件，且證明了槐米中黃酮類物質(zhì)的浸提符合一般中草藥浸提的動力學(xué)模型，為以槐米為原料藥的藥品的生產(chǎn)加工提供了更科學(xué)的依據(jù)，能夠節(jié)約生產(chǎn)成本，具有重要的現(xiàn)實意義.

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Alcohol extraction analysis of flavonoids in Sophora japonica based on three-dimensional fluorescence spectroscopy

YAO Hanxun， SU Hui， WEN Jian， YAO Zhixiang*

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology，

Liuzhou 545006， China）

Abstract： Using fluorescence total volume integration algorithm， combined with three-dimensionalfluorescence spectroscopy technology， the flavonoids in the methanol extract of Sophora japonica were analyzed. The variation of substance content with extraction conditions during the extraction process was studied， and the extraction kinetic model was verified. Taking rutin as the contro， methanol as the extraction solvent， setting conditions of different time， solvent volume and temperature， and analyze the extraction of flavonoids in the methanol extract of Sophora japonica under various conditions; and based on the mathematical model of Chinese herbal medicine extraction Kinetic verification of the extraction process of Sophora japonica under different conditions. The results showed that the optimal conditions for extracting flavonoids from the methanol extract of Sophora japonica were the extraction temperature of 333 K，the time of no less than 80 minutes and the solvent volume no more than 100 mL/g; in the study of extraction kinetics lnC was compared with lnt and ln（M-R），（1/T）×103 are linear， which accords with the mathematical model of Chinese herbal medicine extraction.

Key words： Sophora japonica; flavonoids; alcohol extraction; three-dimensional fluorescence; kinetics

（責(zé)任編輯：羅小芬、黎?? 婭）

收稿日期：2020-10-20

基金項目：廣西重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（桂科AB16380348）資助.

作者簡介：姚涵尋，碩士研究生.

通信作者：姚志湘，博士，教授，研究方向：化學(xué)工程和過程分析技術(shù)，E-mail：zxyao@gxust.edu.cn.