鄒 靜，黃 鶯，李熙全，昝建朋，張 權(quán)，明 堂，蒙 駿

（1. 貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省煙草公司安順市公司，貴州 安順 561000）

健康土壤是農(nóng)產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量的重要保障。近年來，在集約化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，土壤過度使用和不合理的管理制約了土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能。目前，較高的復(fù)種指數(shù)、單一的作物種植、藥肥過量施用等現(xiàn)狀，導(dǎo)致土壤微生物多樣性下降，微生物區(qū)系失衡，土傳病害增加，嚴(yán)重影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量[1]。土壤微生物的數(shù)量、活性、生理或行為的變化是反映土壤健康狀況的重要指標(biāo)[2]。學(xué)者們常用土壤微生物量、生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)和功能基因表達(dá)等來反映土壤健康狀況[3-5]，為探討田間養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化、土傳病害預(yù)防提供了可行方法。前人的研究表明，調(diào)整種植模式會(huì)改善土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)，減輕烤煙連作帶來的危害[6]；種植不同的作物會(huì)影響?zhàn)B分循環(huán)及供應(yīng)，微生物群落結(jié)構(gòu)也會(huì)因此改變[7]；王飛等[8]在研究翻壓不同綠肥對植煙土壤細(xì)菌類群影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，翻壓綠肥的微生物多樣性顯著高于不翻壓綠肥的，翻壓不同的綠肥對作物產(chǎn)生的影響也不相同；祖?zhèn)ボ姷萚9]從土壤微生物豐度與酶活性2個(gè)方面探討了翻壓綠肥對土壤的影響，得出翻壓綠肥可以提高土壤微生物的豐度，增加有關(guān)氮循環(huán)相關(guān)的酶活性等結(jié)論；劉勇軍等[10]發(fā)現(xiàn)添加了有機(jī)物料的土壤中部分酶活性提升、煙葉品質(zhì)也得到改善。

當(dāng)前貴州的耕地復(fù)種指數(shù)仍然較高，并且在短時(shí)間內(nèi)這一情況不會(huì)改變。與此同時(shí)，農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，促使烤煙前茬作物種類和耕作模式變化，烤煙種植制度正發(fā)生著變化。從傳統(tǒng)的“玉米或水稻—油菜—烤煙”種植模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤笆卟恕卟嘶蛐蓍e—烤煙”模式，在此影響下，新的土壤微生物區(qū)系與結(jié)構(gòu)必將重新構(gòu)建。探明不同前茬作物對植煙土壤微生物群落多樣性的影響，篩選出有利于農(nóng)田生態(tài)環(huán)境改善和烤煙產(chǎn)、質(zhì)量提高的前茬種植模式，可為合理調(diào)整和優(yōu)化配置植煙土壤的不同土地種植模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試地點(diǎn)和供試土壤

試驗(yàn)于2019年在貴州省安順市西秀區(qū)楊武鄉(xiāng)進(jìn)行。供試土壤為黃壤，其基本理化為：pH值5.95，有機(jī)質(zhì)含量51.33 g/kg，堿解氮265.32 mg/kg，有效磷25.70 mg/kg，速效鉀168.55 mg/kg，容重0.91 g/cm3。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇貴州冬季種植較為廣泛的作物參試，以冬閑為對照，共設(shè)置4個(gè)前茬處理，分別為：紫云英（KY1，綠肥翻壓還田）、黑麥草（KY2）、白菜（KY3）、冬閑（KY4，CK），每個(gè)處理3次重復(fù)。小區(qū)面積133.4 m2。

2019年10月15日整地并播種紫云英、黑麥草，同時(shí)進(jìn)行白菜育苗，11月28日移栽白菜。紫云英、黑麥草、撂荒處理均不施肥，白菜處理在移栽7 d后施用尿素6.06 kg/667m2。作物栽培至2020年3月，3月17日采收白菜、黑麥草后整地，紫云英（綠肥）直接翻壓后整地。

1.3 土壤樣品采集

烤煙種植起壟施肥前，于2020年4月17日在每個(gè)小區(qū)用5點(diǎn)取樣法采集土壤樣品，采樣深度0～45 cm。土壤樣品采集以后立即放入預(yù)先滅菌的羊皮紙袋密封，放入冰盒暫存，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入超低溫冰箱（-80℃）保存，用于微生物多樣性研究。

1.4 土壤微生物DNA提取及測序

采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit從土壤樣品中提取細(xì)菌總基因組DNA，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，便于PCR擴(kuò)增。細(xì)菌擴(kuò)增區(qū)間為16S rDNA的V3～V4區(qū)，引物為515F（5'-GTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGTW TCTAAT-3'）。PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒（QIAGEN公司）回收目的條帶。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，通過NovaSeq6000上機(jī)測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對Illumina NovaSeq測序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，利用Uparse軟件對所有樣本的全部有效序列進(jìn)行聚類，按照97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時(shí)選取OTUs的代表性序列，生成OTU表格。用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析獲得分類學(xué)信息，并按界門綱目科屬種統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。細(xì)菌Alpha多樣性由Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）、ACE指數(shù)表征。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間的差異采用除趨勢對應(yīng)分析表征。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理土壤樣本細(xì)菌測序數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過高通量測序，共獲得307 226條高質(zhì)量的有效序列，其中KY3處理的高質(zhì)量有效序列最多為86 324條，KY2的最少，為72 656條；平均序列長度除KY4為414 nt外，其他處理均為415 nt；覆蓋率的范圍為98.6%～99.0%，說明樣品中絕大部分細(xì)菌的序列能夠被測出，可以反映細(xì)菌群落的真實(shí)情況（表1）。從圖1可以看出，隨著樣本容量和序列數(shù)的增加，OTU的增加速率逐漸減緩，然后會(huì)趨于平坦，即使檢測樣本量增多，也只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，最終OTU總量趨于定值。這表明，取樣的數(shù)量及深度在一定程度上可以覆蓋整個(gè)群落。

表1 不同前茬作物土壤細(xì)菌測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖1 不同前茬作物土壤細(xì)菌稀釋曲線

由圖2可知，KY1、KY2、KY3、KY4處理的土壤樣品中OTU數(shù)量分別為3 479、3 183、3 321和3 356個(gè)，4個(gè)處理共有的OUT數(shù)量為2 144個(gè)，分別占各處理OUT總數(shù)的61.63%、67.36%、64.56%、63.89%。KY1、KY2、KY3、KY4處理特有的OUT數(shù)量分別為222、113、173、260個(gè)，依次占各處理OTU總數(shù)的6.38%、3.55%、5.21%、7.74%。其中KY4處理獨(dú)有OTU數(shù)量最多，預(yù)示著該處理樣本中含有較多的特有微生物種類。

圖2 不同前茬作物土壤細(xì)菌venn圖

2.2 不同前茬作物對植煙土壤細(xì)菌多樣性的影響

Alpha多樣性可分析樣品內(nèi)菌種類別的豐富度和菌種數(shù)目的均勻度，Alpha多樣性越高，細(xì)菌種類越豐富，群落越穩(wěn)定[11]。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)屬于豐富度指數(shù)，用于估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，群落物種的豐富度越高則其值越高[12]；辛普森、香農(nóng)指數(shù)反映物種優(yōu)勢度[13]。由表2中可知，KY1、KY2、KY3處理的辛普森指數(shù)差異不顯著，但是均顯著高于KY4，說明冬季土壤休閑后，細(xì)菌多樣性降低，分布不均勻；香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)也均以KY4處理的最低，但處理間無明顯差異；說明KY4土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及豐富度劣于其他處理。KY1的4項(xiàng)指數(shù)均最高，說明種植紫云英，且從綠肥的形式翻壓還田更有利于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

2.3 不同前茬作物處理下植煙土壤細(xì)菌組成的差異

相似的生態(tài)環(huán)境下，不同處理土壤細(xì)菌在門水平上具有較高的相似性，4個(gè)處理間相對豐度排名前10的優(yōu)勢細(xì)菌所占比例均達(dá)到95%以上。盡管各優(yōu)勢菌門所占比例有差異，但前10個(gè)優(yōu)勢菌門在4個(gè)處理間是相同的（圖3），包括Proteobacteria（變形菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Latescibacteria和unidentified Bacteria（未知細(xì)菌門），Others（其他）表示10個(gè)門之外的其他所有門的相對豐度之和；優(yōu)勢菌門中以變形菌門和酸桿菌門為主，占總序列的54.81%～63.31%；酸桿菌門在KY4處理中占比僅為17.08%，顯著低于其余3個(gè)處理，但厚壁菌門在KY4處理中占比高于其他3個(gè)處理，但差異未達(dá)到顯著水平。

表2 不同前茬作物土壤細(xì)菌Alpha多樣性指標(biāo)

圖3 不同前茬作物土壤細(xì)菌在門水平上的相對豐度

不同前茬作物導(dǎo)致土壤細(xì)菌在門水平上存在數(shù)量與種類的差異，4個(gè)處理中KY1的獨(dú)有菌門最多，有6種，分別是Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Nitrospirae、Nitrospinae和Margulisbacteria；KY3有3個(gè)獨(dú)有菌門，分別為Euryarchaeota、Parcubacteria和Gracilibacteria；KY2與KY4無獨(dú)有菌門。

3 結(jié)論與討論

微生物群落結(jié)構(gòu)受種植作物的影響[14]?，F(xiàn)有不少研究已經(jīng)證明，不同的土地利用方式、翻壓不同作物會(huì)影響土壤微生物所處的環(huán)境，從而導(dǎo)致其組成與豐度的差異，產(chǎn)生共有的或特異的群落結(jié)構(gòu)[15-19]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，各處理土壤細(xì)菌物種數(shù)由高到低排列依次為KY1＞KY3＞KY4＞KY2，處理間差異不顯著；KY1、KY2、KY3處理的辛普森指數(shù)顯著高于KY4（冬閑，CK），說明對照處理的物種優(yōu)勢度低；而各處理的香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)差異不顯著。

試驗(yàn)結(jié)果還顯示，不同處理間土壤細(xì)菌均以變形菌門、酸桿菌門為主，這2種菌門都是土壤中較重要的菌門，其在土壤生物化學(xué)循環(huán)中起著重要作用[20]。變形菌門與根瘤菌的共生固氮密切相關(guān)[21]，研究中它是第一優(yōu)勢菌門，可能是因?yàn)樽冃尉T是嗜養(yǎng)菌門，翻壓作物增加了土壤中有機(jī)質(zhì)的含量，所以相對豐度較高。變形菌門可以提高土壤質(zhì)量，促進(jìn)植株生長[22]，而KY4的變形菌門相對豐度高于其他處理，可見人為干擾較少的土壤韌性高，與林耀奔等[23]研究不同土地利用方式對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響中的結(jié)論一致。酸桿菌門排名次之，因?yàn)樗釛U菌門中含有豐富的編碼纖維素酶和淀粉水解酶的基因序列，所以可以分解動(dòng)植物殘?bào)w，改善農(nóng)田土壤碳循環(huán)[24]，取樣時(shí)土壤里植株殘?bào)w正是豐富的時(shí)候，酸桿菌門豐度自然較高。

研究還發(fā)現(xiàn)，KY1處理有6種特異菌門，分別為Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Nitrospirae、Nitrospinae和Margulisbacteria；其 中，Nitrospirae與Nitrospinae是亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，主要功能是能將亞硝氮轉(zhuǎn)為硝氮，推動(dòng)氮循環(huán)[25-26]；Margulisbacteria主要參與氮還原、亞硝酸鹽還原、硫酸鹽還原，推動(dòng)硫、氮、碳循環(huán)，說明種植紫云英促進(jìn)了土壤氮循環(huán)，不僅通過固氮作用提高了土壤氮含量，還促使土壤氮的分解轉(zhuǎn)化，但是紫云英翻壓后的分解，可能會(huì)因消耗大量土壤氧氣而引起還原過程加??；Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria和Hydrogenedentes等菌門目前為止還未鑒定出具體功能。KY3有3種獨(dú)有菌門，分別是Euryarchaeota、Parcubacteria和Gracilibacteria，其中Euryarchaeota含有產(chǎn)甲烷古菌和甲烷氧化古菌，是地球碳代謝循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)力[27]，Parcubacteria和Gracilibacteria還未見在土壤功能方面的報(bào)道。

研究僅從微生物多樣性方面對烤煙前茬作物進(jìn)行了探討，之后可以結(jié)合土壤理化性質(zhì)進(jìn)行綜合評價(jià)，選擇最優(yōu)的烤煙前茬作物。另外，研究中發(fā)現(xiàn)的Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Parcubacteria和Gracilibacteria這5種菌門的功能未見具體報(bào)道，之后可對其在土壤中的功能進(jìn)行鑒定。