席嘯虎

山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012

糖尿病在中醫(yī)屬于消渴范疇，以陰液虧損為本、燥熱偏勝為標(biāo)[1]。麥冬養(yǎng)陰潤燥、清熱生津，能療消渴陰虛之本[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，麥冬發(fā)揮降血糖作用的成分多為麥冬多糖[3]。麥冬中還含有70余種甾體皂苷、30余種高異黃酮類化合物[4]，其是否有潛在降血糖活性尚未明確。

中藥中復(fù)雜的化學(xué)成分通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用，通過配伍和組方與其他藥味相互作用，共同發(fā)揮藥效[5-6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥學(xué)的基本特點(diǎn)相吻合，有利于揭示中藥復(fù)雜的作用機(jī)制[7]。

中醫(yī)治療糖尿病主要以清熱潤燥、養(yǎng)陰生津?yàn)橹?。由于本病常發(fā)生血脈瘀滯及陰損及陽的病變，且易并發(fā)癰疽、眼疾、勞嗽等證，故還應(yīng)針對具體病情，及時(shí)合理地選用活血化瘀、清熱解毒、健脾益氣、滋補(bǔ)腎陰、溫補(bǔ)腎陽等治法。麥冬養(yǎng)陰潤燥、清熱生津，療消渴陰虛之本，黃芪補(bǔ)氣升陽、布津攝液；北沙參多入上焦，清肺熱、養(yǎng)肺陰，麥冬善入中焦，清胃熱、益胃陰，兩藥相須為用；丹參活血化瘀，黃連清熱瀉火，配伍麥冬增強(qiáng)清熱之力，使火去而津液自復(fù)，補(bǔ)虛而瀉實(shí)；麥冬-山藥-五味子3藥合用，可增強(qiáng)補(bǔ)腎養(yǎng)陰、潤肺作用。本研究依據(jù)中醫(yī)補(bǔ)氣、滋陰、清熱、活血、酸甘化陰等治療糖尿病基本的組方配伍方式[8]，研究麥冬單味藥及配伍后治療糖尿病的潛在活性成分及作用機(jī)制，為進(jìn)一步結(jié)合麥冬配伍后成分變化規(guī)律、血清藥物化學(xué)[9]、代謝組學(xué)[10]、體外及體內(nèi)降血糖活性追蹤等方法探究其具體成分群提供參考。

1 材料與方法

1.1 麥冬及其配伍后化學(xué)成分與靶點(diǎn)的獲取

釆用TCMID(http：//www.megabionet.org/tcmid/)、Batman-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合文獻(xiàn)挖掘的方法，收集麥冬單味藥及其配伍的化學(xué)成分[11]。

根據(jù)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫默認(rèn)的閾值(prediction score cutoff>20)，篩選可信度高的蛋白作為候選靶點(diǎn)，其中麥冬為重點(diǎn)研究對象，閾值選擇prediction score cutoff>15。使用UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)中UniProtKB功能，限定蛋白物種為人，校正蛋白名稱。

1.2 糖尿病作用靶點(diǎn)的獲取

在CTD(http：//ctdbase.org/)、TTD (http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、DrugBank (https：//www.Drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫輸入diabetes、diabetes mellitus等關(guān)鍵詞，獲得糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)[11]。

1.3 藥味-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選得到的成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件(http：//www.cytoscape.org/)，構(gòu)建藥味-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)[11]。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

使用STRING 10.0(http：//string-db.oig/)工具構(gòu)建麥冬及其配伍后靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治龊湍K分析。拓?fù)浞治霾捎肅ytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行Network Analyzer分析。以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值度(degree)和中介中心度(betweenness centrality，BC)為指標(biāo)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。模塊分析采用Cytoscape 3.7.2軟件ClusterViz插件中的MCODE算法，設(shè)置score>2，即至少包含3條邊[12]。

1.5 通路分析

通過DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對上述預(yù)測得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路注釋分析，并運(yùn)用GraphPad Prism 5繪圖[12]。

2 結(jié)果

2.1 麥冬及其配伍后成分和靶點(diǎn)篩選

共篩選得到麥冬化學(xué)成分22個(gè)、靶點(diǎn)236個(gè)，黃芪化學(xué)成分和靶點(diǎn)分別為35、415個(gè)，麥冬與黃芪配伍共有靶點(diǎn)為96個(gè)；黃連化學(xué)成分和靶點(diǎn)分別為23、132個(gè)，麥冬與黃連配伍共有靶點(diǎn)為24個(gè)；山藥化學(xué)成分和靶點(diǎn)分別為20、478個(gè)，五味子化學(xué)成分和靶點(diǎn)分別為112、930個(gè)，麥冬與山藥、五味子配伍共有靶點(diǎn)為146個(gè)；丹參化學(xué)成分和靶點(diǎn)分別為75、769個(gè)，麥冬與丹參配伍共有靶點(diǎn)為82個(gè)；北沙參化學(xué)成分和靶點(diǎn)分別為17、181個(gè)，麥冬與北沙參配伍共有靶點(diǎn)為172個(gè)。

2.2 糖尿病靶點(diǎn)篩選

基于多個(gè)數(shù)據(jù)庫共檢索到糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)181個(gè)，其中麥冬涉及靶點(diǎn)20個(gè)，占糖尿病靶點(diǎn)數(shù)的11.05%；麥冬與黃芪共有相關(guān)靶點(diǎn)13個(gè)，黃芪涉及靶點(diǎn)27個(gè)，分別占糖尿病靶點(diǎn)數(shù)的7.18%、14.91%；麥冬與黃連共有相關(guān)靶點(diǎn)9個(gè)，黃連涉及靶點(diǎn)13個(gè)，分別占糖尿病靶點(diǎn)數(shù)的4.97%、7.18%；麥冬與山藥共有相關(guān)靶點(diǎn)14個(gè)，山藥涉及靶點(diǎn)32個(gè)，分別占糖尿病靶點(diǎn)數(shù)的7.73%、17.68%；麥冬與五味子共有相關(guān)靶點(diǎn)13個(gè)，五味子涉及靶點(diǎn)41個(gè)，分別占糖尿病靶點(diǎn)數(shù)的7.18%、22.65%；麥冬與丹參共有相關(guān)靶點(diǎn)9個(gè)，丹參涉及靶點(diǎn)41個(gè)，分別占糖尿病靶點(diǎn)數(shù)的4.97%、22.65%；麥冬與北沙參共有相關(guān)靶點(diǎn)11個(gè)，北沙參涉及靶點(diǎn)13個(gè)，分別占糖尿病靶點(diǎn)數(shù)的6.08%、7.18%；麥冬與各藥味配伍后，涉及靶點(diǎn)58個(gè)，占糖尿病靶點(diǎn)數(shù)的32.04%。藥味-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1。

圖1 麥冬及其配伍治療糖尿病的藥味-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

使用STRING工具構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。其中麥冬單味藥治療糖尿病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)包括20個(gè)節(jié)點(diǎn)和24條邊；麥冬與黃芪配伍治療糖尿病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)包括33個(gè)節(jié)點(diǎn)和74條邊；麥冬與黃連配伍治療糖尿病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)包括24個(gè)節(jié)點(diǎn)和36條邊；麥冬與丹參配伍治療糖尿病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)包括51個(gè)節(jié)點(diǎn)和259條邊；麥冬與北沙參配伍治療糖尿病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)包括22個(gè)節(jié)點(diǎn)和33條邊；麥冬與山藥、五味子配伍治療糖尿病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)包括48個(gè)節(jié)點(diǎn)和244條邊；麥冬與所有藥味共同配伍后，共包括58個(gè)節(jié)點(diǎn)和330條邊。

注：A.麥冬與其他藥味配伍；B.麥冬單味藥；FBP1、MTTP、PPARD、PNP等無蛋白間相互作用。圖2 麥冬及其配伍治療糖尿病活性靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

麥冬配伍后治療糖尿病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治鼋Y(jié)果見表1。通過對連接度排序靠前的靶點(diǎn)及麥冬單味藥靶點(diǎn)進(jìn)行模塊分析，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶B1(Akt1)、大麻素受體1(CNR1)、多巴胺受體D2(DRD2)等為主要相關(guān)靶點(diǎn)，預(yù)測麥冬及其配伍通過影響中樞系統(tǒng)進(jìn)而調(diào)節(jié)血糖。模塊分析結(jié)果顯示，score>2的靶點(diǎn)根據(jù)打分排序聚成3類，不同模塊對應(yīng)參數(shù)見表2，靶點(diǎn)間相互關(guān)系見圖3，模塊對應(yīng)的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組成(CC)及KEGG通路富集分析見表3。

表1 麥冬配伍后治療糖尿病靶點(diǎn)的拓?fù)鋵傩苑治?前20位)

表2 麥冬配伍后治療糖尿病靶點(diǎn)模塊參數(shù)

圖3 麥冬配伍后治療糖尿病靶點(diǎn)模塊關(guān)聯(lián)分析

表3 麥冬配伍后治療糖尿病靶點(diǎn)富集分析

2.4 通路分析

2.4.1GO富集分析 將麥冬及其配伍治療糖尿病交集網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，從BP、MF、CC 3個(gè)不同角度對基因功能進(jìn)行注釋[P<0.05，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05]。GO富集分析結(jié)果顯示，麥冬單味藥靶標(biāo)基因主要富集在58個(gè)BP、19個(gè)CC和6個(gè)MF。麥冬配伍后靶標(biāo)基因富集在206個(gè)BP、31個(gè)CC和18個(gè)MF。其中按照顯著性由高到低進(jìn)行排序，排名前14位的結(jié)果見圖4～5。

圖4 麥冬治療糖尿病GO富集分析

圖5 麥冬配伍后GO富集分析

2.4.2KEGG分析 將麥冬及其配伍治療糖尿病交集網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，麥冬單味藥具有顯著意義的通路有14條，配伍后增加至63條(P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)。排名前14位的結(jié)果見圖6～7。

圖6 麥冬治療糖尿病KEGG通路分析

圖7 麥冬配伍后KEGG通路分析

3 討論

本研究結(jié)果表明，麥冬單味藥中麥冬皂苷、麥冬黃烷酮、甲基麥冬黃烷酮等成分可以直接作用于相關(guān)靶點(diǎn)起到糖尿病治療作用。麥冬配伍后，治療糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)增加，成分之間相互作用也增加。其中，涉及到的活性成分包括黃芪中的黃芪甲苷類、黃芪素等，五味子中的五味子醇甲、木脂素類、烯類等，黃連中的生物堿類，山藥中的尿囊素、山藥素，丹參中的丹參酮類、丹參酚醌類及北沙參中的槲皮素、谷甾醇等。說明麥冬可能通過與其他藥味或其中成分的相互作用及靶點(diǎn)蛋白之間相互作用增強(qiáng)治療糖尿病的活性并擴(kuò)大功能通路?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析，麥冬甲基高異黃酮A和麥冬甲基高異黃酮B表現(xiàn)出直接或間接的治療糖尿病活性，可作為重點(diǎn)研究對象。

依據(jù)PPI分析、模塊分析、通路分析及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫蛋白可信度值 (prediction score)等結(jié)果顯示，麥冬單味藥涉及的關(guān)鍵靶點(diǎn)為Akt1、CNR1、DRD2等，KEGG通路主要涉及Ras相關(guān)蛋白1(Rap1)、環(huán)磷腺苷(cAMP)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等，生物學(xué)過程主要包括三磷酸腺苷結(jié)合(ATP binding)、質(zhì)膜(plasma membrane)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)等。麥冬通過配伍新增關(guān)鍵靶點(diǎn)為INS、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等，新增通路為磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)、癌癥(cancer)、TNF等，新增生物學(xué)過程為蛋白結(jié)合(protein binding)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)等。下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamo-pituitary-adrenal，HPA)軸作為機(jī)體能量代謝的調(diào)節(jié)中樞，在2型糖尿病發(fā)生過程中起重要作用。下丘腦內(nèi)分布有大量CNR1，大麻素系統(tǒng)可廣泛調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的功能。CNR1可通過調(diào)節(jié)HPA軸改善2型糖尿病指標(biāo)[13]。PI3K/Akt是胰島素信號傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑，DRD2可通過影響下游細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵基因PI3K、Akt在外周細(xì)胞中的表達(dá)水平改善糖代謝[14]，但配伍成分及具體機(jī)制不明確，是麥冬相關(guān)研究的關(guān)鍵突破點(diǎn)。Rap1是一種控制細(xì)胞粘附、細(xì)胞-細(xì)胞連接形成和細(xì)胞極性等多種過程的小三磷酸鳥苷環(huán)水解酶(GTPase)，可調(diào)控下游PI3K、Akt因子，改善血糖水平。cAMP是環(huán)核苷酸系統(tǒng)的一種，腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷腺苷-蛋白激酶A(AC-cAMP-PKA)途徑在糖尿病大鼠周圍神經(jīng)中表達(dá)水平下降，活性成分通過調(diào)控AC-cAMP-PKA途徑防治糖尿病神經(jīng)病變[15]。AMPK對糖代謝的調(diào)節(jié)主要是增加葡萄糖攝取，增加糖酵解并抑制糖異生，AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，激活后能夠改善胰島素敏感性及葡萄糖穩(wěn)態(tài)，對糖代謝的調(diào)節(jié)主要是增加葡萄糖攝取，增加糖酵解并抑制糖異生[16]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步確定麥冬單味藥及其配伍后改善糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，麥冬治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)與其配伍、組方密不可分，通過有效配伍后作用通路顯著增加。該結(jié)果提示，麥冬中的部分化學(xué)成分可以通過直接作用治療糖尿病，另一些成分可以通過配伍促進(jìn)其他成分顯效或被其他成分輔助顯效，其中涉及的所有成分，均可認(rèn)定為麥冬治療糖尿病物質(zhì)基礎(chǔ)組群。這種配伍后活性和機(jī)制的改變與化學(xué)成分含量改變有關(guān)，同時(shí)與成分作用的蛋白靶點(diǎn)之間的相互作用有關(guān)。本課題組后續(xù)擬進(jìn)一步基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)、配伍后成分變化情況、活性成分追蹤結(jié)果、血清藥物化學(xué)分析等，通過多層次信息挖掘與融合，總結(jié)麥冬治療糖尿病相關(guān)活性組分群。通過在活性組分群中主要成分有序、有效捕獲(增加)/扣除(減少)后體外、體內(nèi)活性對比研究，明確麥冬相關(guān)配伍成分及其作用貢獻(xiàn)度。