周新麗 李嘉慧 杜羽琨

(上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093)

體外模型的建立對于腫瘤發(fā)病基因的篩查以及抗腫瘤新藥的研發(fā)至關(guān)重要。二維細(xì)胞培養(yǎng)模型廣泛應(yīng)用于各種藥物篩選研究，但腫瘤的發(fā)生與腫瘤所處周圍的微環(huán)境密切相關(guān)[1]，體內(nèi)腫瘤呈現(xiàn)的立體結(jié)構(gòu)、內(nèi)外酸堿度平衡以及需氧平衡并不能在二維模型中充分體現(xiàn)，導(dǎo)致臨床治療效果與二維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較大差異。人源腫瘤異種移植模型(PDX，patient-derived tumor xenograft)是指將手術(shù)切除的病人腫瘤組織接種于免疫缺陷鼠體內(nèi)而建立的新一代腫瘤模型，藥效學(xué)結(jié)果與臨床有較好的相關(guān)性，但是存在不可用于高通量篩選，不能完全模仿人體的自然生物反應(yīng)[2]，且造價昂貴等問題。由細(xì)胞微團(tuán)、細(xì)胞聚集體構(gòu)建的三維細(xì)胞模型，能夠復(fù)制體內(nèi)細(xì)胞的分化、增殖和體外功能，相比于二維培養(yǎng)的細(xì)胞具有高度生理相關(guān)性[3]，相比于PDX 模型，其建立更為方便且廉價，逐漸成為腫瘤研究領(lǐng)域中更合適的體外研究模型[4－5]。

目前在腫瘤細(xì)胞三維模型的培養(yǎng)方面已取得顯著成績。徐紅等[6]在體外通過使用膠原支架材料復(fù)合乳腺癌細(xì)胞成功構(gòu)建乳腺癌三維模型并用于耐藥性篩選。J.F.Cadavid-Vargas 等[7]使用瓊脂糖鋪板制作低黏附底面的孔板并接種肺癌細(xì)胞，在體外成功培養(yǎng)了用于藥物篩選的肺癌細(xì)胞微團(tuán)。但由于細(xì)胞微團(tuán)的培養(yǎng)需要較長時間，需要時再進(jìn)行培養(yǎng)會導(dǎo)致試驗(yàn)周期過長，藥物篩選的效率大大降低。對細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)并進(jìn)行有效的長期保存，異地使用或者需要使用時對微團(tuán)復(fù)溫培養(yǎng)并保持活性及功能，將會大大提高使用效率。此外，類器官技術(shù)作為近年發(fā)展迅速的三維體外培養(yǎng)技術(shù)，是未來作為藥物篩選的完美模型，對細(xì)胞微團(tuán)有效長期保存的探索也是為類器官樣本庫的建立做好技術(shù)準(zhǔn)備。

低溫保存是生物樣本長期保存及運(yùn)輸最為常用的方法[8]。常規(guī)慢速冷凍已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞株以及細(xì)胞微團(tuán)的保存[9－11]，玻璃化冷凍是指使液相不發(fā)生結(jié)晶而直接轉(zhuǎn)化成玻璃態(tài)固相的冷凍方法。相比于慢速冷凍，玻璃化冷凍可以有效阻止冰晶的形成，目前已成功應(yīng)用于生殖細(xì)胞的保存[12－13]。S.Sart等[14]使用慢速冷凍對胚胎干細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行低溫保存，復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)的存活率為65%～68%，慢速冷凍降溫過程中因?yàn)楸У男纬稍斐杉?xì)胞及微團(tuán)的損傷。Li Tao 等[15]使用直接接觸液氮的玻璃化方法對胚胎干細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行低溫保存，復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)存活率為94.3%。但目前對于腫瘤細(xì)胞微團(tuán)的低溫保存研究較少，對于其最適宜的凍存方法、保護(hù)劑體積濃度尚無定論。此外，當(dāng)前玻璃化冷凍保存的另一個局限性在于樣本直接接觸液氮而造成污染，因此選擇合理的玻璃化冷凍載體也非常重要。

本文采用低黏附率U 型96 孔板培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞微團(tuán)，研究培養(yǎng)天數(shù)和接種密度對細(xì)胞微團(tuán)尺寸的影響；其次，采用凍存管、塑料麥管、玻璃毛細(xì)管作為冷凍載體，采用不同濃度的保護(hù)劑對細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行低溫保存，對復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)相對新鮮組細(xì)胞微團(tuán)活力以及增殖率進(jìn)行檢測，篩選低溫保存肺癌細(xì)胞微團(tuán)的最佳方法；最后對冷凍載體的降溫速率以及保護(hù)劑的臨界降溫速率進(jìn)行測定，對細(xì)胞微團(tuán)低溫保存的熱力學(xué)機(jī)理進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)與材料

1.1 主要試劑和藥品

細(xì)胞株:人肺腺癌細(xì)胞株A549，購于中國上海富恒生物科技有限公司；胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、AO/PI 溶液、CCK－8 試劑盒(上海勵瑞生物科技有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，Me2SO，艾普力，德國)；乙二醇(EG，ethylene glycol)、海藻糖(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；阿爾瑪藍(lán)試劑盒(上海懋康生物科技)。

1.2 三維細(xì)胞模型培養(yǎng)

使用液體覆蓋法構(gòu)建三維細(xì)胞微團(tuán)模型[16]，低黏附率U 型96 孔板(上海迪盼生物科技有限公司)是在96 孔板中注入特殊處理的聚苯乙烯等相關(guān)材料，在表面張力作用下形成凹液面，材料冷凝后即形成利于細(xì)胞聚集生長但不利于細(xì)胞貼壁的低黏附率表面。細(xì)胞懸液加入孔中，重力作用下大部分細(xì)胞自然沉降至凹面最低處，細(xì)胞由于不能貼壁生長被迫聚集生長成腫瘤球。

將肺癌細(xì)胞A549 重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液(含有體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL 的DMEM 試劑)并接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2、70%濕度的培養(yǎng)箱(上海博訊)中培養(yǎng)。取生長于對數(shù)期的細(xì)胞直至達(dá)到80%～90%匯合時，胰酶消化并重懸至完全培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)，分別稀釋細(xì)胞懸液濃度為1×104個/mL、2×104個/mL、5×104個/mL、1×105個/mL，并分別接種于低黏附率U 型96 孔板中，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。連續(xù)培養(yǎng)5 d，在顯微鏡下對微團(tuán)形成過程進(jìn)行拍照，并統(tǒng)計(jì)尺寸，每隔一天用新鮮的培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基。

1.3 肺癌細(xì)胞微團(tuán)的慢速冷凍

以DMEM 作為基礎(chǔ)溶液，由基礎(chǔ)溶液配置體積分?jǐn)?shù)為10%的Me2SO 作為低溫保護(hù)劑，將配制好的低溫保護(hù)劑用0.22 μm 針式濾器過濾除菌，用封口膜封住瓶口放置于4 ℃冰箱中備用。選取狀態(tài)良好的細(xì)胞微團(tuán)，使用20 uL 移液槍將細(xì)胞微團(tuán)轉(zhuǎn)移至1.8 mL 凍存管(康寧)中，添加1 mL 低溫保護(hù)劑，在4 ℃平衡5 min。

細(xì)胞微團(tuán)慢速冷凍分為兩組:一組凍存管放入4℃預(yù)冷的程序降溫盒(5100－0001C，上海勵瑞生物科技有限公司)中，再放入－80 ℃冰箱，在此條件下程序降溫盒中的凍存管降溫速率為1 ℃/min，24 h 后將凍存管放入液氮進(jìn)行低溫保存；另一組凍存管放入程控降溫儀(Kryo360，Planer，英國)，設(shè)置降溫程序:從4℃以0.5 ℃/min 速度降至－40 ℃后，再以1 ℃/min降至－80 ℃后，直接放入液氮中進(jìn)行低溫保存。

復(fù)溫時從液氮中取出凍存管，37 ℃水浴復(fù)溫，當(dāng)凍存管里液體及微團(tuán)全部融化后，吸取細(xì)胞微團(tuán)至1.5 mL 離心管中，并加入1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹勻，平衡10 min 后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4 肺癌細(xì)胞微團(tuán)的快速及玻璃化冷凍

以DMEM 作為基礎(chǔ)溶液，配置三種低溫保護(hù)劑VS1、VS2、VS3。VS1 為基礎(chǔ)溶液配置體積分?jǐn)?shù)為10%的EG、體積分?jǐn)?shù)為10%的Me2SO 及0.5 mol/L海藻糖，溶液摩爾濃度為3.68 mol/L；VS2 為基礎(chǔ)溶液配置體積分?jǐn)?shù)為15%的EG、體積分?jǐn)?shù)為15%的Me2SO 及0.5 mol/L 海藻糖，溶液摩爾濃度為5.27 mol/L，VS3 為基礎(chǔ)溶液配置體積分?jǐn)?shù)為20%的EG、體積分?jǐn)?shù)為20%的Me2SO 及0.5 mol/L 海藻糖，溶液摩爾濃度為6.86 mol/L。將保護(hù)劑溶液稀釋一倍作為對應(yīng)的平衡溶液ES1、ES2、ES3。配置兩種復(fù)溫溶液TS1、TS2，TS1 為基礎(chǔ)溶液配置1 mol/L 蔗糖溶液，TS2 為基礎(chǔ)溶液配置0.5 mol/L 蔗糖溶液。

采用塑料麥管、玻璃毛細(xì)管作為冷凍載體，選取狀態(tài)良好的細(xì)胞微團(tuán)，在平衡溶液(ES1、ES2、ES3)中平衡3 min，然后在對應(yīng)的保護(hù)劑溶液(VS1、VS2、VS3)中平衡30 s，再利用塑料麥管、玻璃毛細(xì)管的虹吸作用，快速將細(xì)胞微團(tuán)連同玻璃化溶液移入麥管或玻璃毛細(xì)管，該過程中應(yīng)保證盡量少吸入保護(hù)劑。將加載好細(xì)胞微團(tuán)及低溫保護(hù)劑的塑料麥管/玻璃毛細(xì)管迅速投入液氮中進(jìn)行低溫保存。

復(fù)溫時將塑料麥管、玻璃毛細(xì)管從液氮中分批次取出，迅速將含有細(xì)胞微團(tuán)的一端插入37 ℃ TS1中，保證裝載細(xì)胞微團(tuán)的一端完全浸沒在TS1 中，完全融化待微團(tuán)流出后平衡1 min，轉(zhuǎn)移至TS2 中平衡3 min。最后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)液中，平衡10 min 進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.5 AO/PI 染色檢測

使用AO/PI 溶液對細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行染色，取新鮮組以及凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞微團(tuán)懸液和AO/PI 溶液各10 μL 滴加至載玻片上，黑暗處孵育5 min 后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，正常細(xì)胞被染色為綠色或黃綠色，晚期凋亡細(xì)胞或死細(xì)胞被染色為紅色。

1.6 細(xì)胞微團(tuán)活力檢測

使用cell count kit－8(CCK－8)對細(xì)胞微團(tuán)的活力測定，將新鮮及復(fù)蘇后的細(xì)胞微團(tuán)在96 孔板中加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，每24 h 將孔中溶液更換為100 μL 含有體積分?jǐn)?shù)為10% CCK－8 的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1 h 后，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測量OD 值。計(jì)算使用不同低溫保存細(xì)胞微團(tuán)相對新鮮組細(xì)胞微團(tuán)活力。

式中:As 為實(shí)驗(yàn)孔(含有復(fù)溫并洗脫后細(xì)胞微團(tuán)、培養(yǎng)基以及CCK－8 溶液)；Ac 為對照孔(含有新鮮組細(xì)胞微團(tuán)、培養(yǎng)基以及CCK－8 溶液)；Ab 為空白孔(含有培養(yǎng)基以及CCK－8 溶液)。

1.7 Alamar blue 增殖檢測

Alamar blue 是一種氧化還原指示劑，能根據(jù)代謝活性產(chǎn)生吸光度變化和熒光信號。對于微團(tuán)增殖的測定，將新鮮及復(fù)蘇后的細(xì)胞微團(tuán)在96 孔板中加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24 h 將孔中溶液更換為100 μL 含有體積分?jǐn)?shù)為10% Alamar blue 的完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀測量570 nm、600 nm 處OD 值。連續(xù)測量3 d，并計(jì)算細(xì)胞微團(tuán)相對于新鮮組細(xì)胞微團(tuán)的增殖率。

式中:A570 為檢測孔在570 nm 波長的吸光度；A600 為檢測孔在600 nm 波長的吸光度；P570 為第0 天檢測孔在570 nm 波長的吸光度；P600 為第0 天檢測孔在600 nm 波長的吸光度。

1.8 細(xì)胞微團(tuán)凍存的熱力學(xué)分析

將適量VS2、VS3 保護(hù)劑加載于塑料麥管、玻璃毛細(xì)管內(nèi)，將測溫元件T 型熱電偶插入塑料麥管、玻璃毛細(xì)管內(nèi)的液體中固定并連接數(shù)據(jù)采集儀(Agilent 34972 A，美國)，設(shè)置數(shù)據(jù)采集儀測溫時間間隔為0.045 s，將麥管、玻璃毛細(xì)管立即浸入液氮，并使用數(shù)據(jù)采集儀讀取溫度變化曲線，選取溫度開始降低的時間段，計(jì)算冷凍載體的降溫速率。

董軼鋒等[17]推導(dǎo)了結(jié)晶動力學(xué)的模型，采用差示量熱掃描儀DSC(DSC8500，PE，美國)，選取一組從小到大的降溫速率vi(i＝1，…，n)，測出相應(yīng)的結(jié)晶放熱量qi(J/g)，若((qi－1-qi)/qi－1)<1%，則可取vi－1所對應(yīng)qi－1為qmax，若定義臨界結(jié)晶率xg為0.05，根據(jù)式(3)～式(5)計(jì)算低溫保護(hù)劑臨界降溫速率vcr。

式中:T0為結(jié)晶起始溫度，℃；v為某次的降溫速率，℃/min；x為結(jié)晶放熱量q與最大可能結(jié)晶放熱量qmax的比例(0

根據(jù)上述計(jì)算方法，對VS1、VS2、VS3 的臨界降溫速率進(jìn)行計(jì)算，將三種溶液的玻璃化臨界降溫速率與冷凍載體可實(shí)現(xiàn)的降溫速率進(jìn)行對比，對使用不同冷凍載體低溫保存細(xì)胞微團(tuán)降溫過程的現(xiàn)象進(jìn)行分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0 軟件中ANOVA(analysis of variance)過程對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、 Duncan 氏多重比較。使用Origin 9.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)天數(shù)對細(xì)胞微團(tuán)形成的影響

在顯微鏡下觀察，二維培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)梭形及多角形貼壁生長，而在三維細(xì)胞模型培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長情況如圖1所示(文中插圖中的黑色或灰色線段代表長度100 μm)。以接種密度為2×104個/mL為例，A549 細(xì)胞呈圓形在完全培養(yǎng)基中懸浮生長，并出現(xiàn)相互黏附的趨勢，在培養(yǎng)第2 天可見由多個細(xì)胞黏附在一起并呈團(tuán)塊狀生長的現(xiàn)象。培養(yǎng)至第3 天時，細(xì)胞微團(tuán)開始形成致密的結(jié)構(gòu)，微團(tuán)直徑為344.24±0.74 μm。培養(yǎng)至第4 天、第5 天時，細(xì)胞微團(tuán)立體結(jié)構(gòu)越來越明顯，形狀更加規(guī)則，結(jié)構(gòu)更加致密。微團(tuán)直徑不斷增加，第4 天時微團(tuán)直徑為366.05 μm±4.85 μm、第5 天微團(tuán)直徑為390.79 μm±7.58 μm。

圖1 接種密度為2×104 個/mL 的微團(tuán)生長狀態(tài)Fig.1 Growth status of cell spheroids at seeding density of 2×104/mL

2.2 細(xì)胞接種密度對細(xì)胞微團(tuán)形成的影響

光鏡下觀察，細(xì)胞接種密度越大，細(xì)胞出現(xiàn)黏附的趨勢越強(qiáng)。不同接種密度下細(xì)胞微團(tuán)尺寸隨培養(yǎng)時間變化曲線如圖2所示。接種密度為1×104個/mL、2×104個/mL、5×104個/mL、1×105個/mL，第3天時微團(tuán)直徑分別為288.14 μm±1.73 μm、344.24 μm±0.74 μm、523.29 μm±6.46 μm、 656.10 μm±4.63 μm，可以看出細(xì)胞接種密度越大，細(xì)胞微團(tuán)初始直徑越大。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，每種接種密度的細(xì)胞微團(tuán)直徑都呈緩慢增加的趨勢，從第3 天到第5天，接種密度為1×104個/mL、2×104個/mL、5×104個/mL、1×105個/mL，微團(tuán)直徑分別增加了30.06 μm±4.91 μm、46.55 μm± 6.84 μm、59.60 μm± 0.58 μm、62.61 μm±14.34 μm。說明接種細(xì)胞密度越大，細(xì)胞微團(tuán)內(nèi)細(xì)胞分裂速度越快，細(xì)胞微團(tuán)直徑的增加速度越快。

圖2 不同接種密度下細(xì)胞微團(tuán)尺寸隨培養(yǎng)時間的變化Fig.2 The relationship of cell spheroids size and culture time at different seeding densities

由于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)的逐漸減少，腫瘤球越往核心合成代謝越弱，而分解代謝越強(qiáng)，最終核心層細(xì)胞死亡。這種現(xiàn)象在腫瘤球直徑超過400 μm 左右時即可出現(xiàn)，具有增殖活力的細(xì)胞多集中于腫瘤球外層0～300 μm 的區(qū)域內(nèi)[18－19]。為保證形成微團(tuán)的增殖能力，選擇小于400 μm 的細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行低溫保存，從微團(tuán)的形成效果進(jìn)行觀察，接種密度為2×104個/mL 時，微團(tuán)形成的狀態(tài)好于接種密度為1×104個/mL，故使用接種密度為2×104個/mL 進(jìn)行接種，培養(yǎng)至3～4 天時進(jìn)行低溫保存。

2.3 慢速冷凍肺癌細(xì)胞微團(tuán)

使用程序降溫盒與程控降溫儀對凍存管中的肺癌細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行慢速冷凍，復(fù)溫后經(jīng)AO/PI 染色存活率的結(jié)果如圖3所示。由圖可知，使用不同凍存體系低溫保存的細(xì)胞微團(tuán)中都存在大量細(xì)胞凋亡甚至死亡。使用程序降溫盒與程控降溫儀低溫保存對細(xì)胞微團(tuán)的活力以及增殖能力的影響結(jié)果見表1?？梢钥闯?，使用不同慢速凍存體系低溫保存的肺癌細(xì)胞微團(tuán)相對新鮮組的活力無顯著差異(69.36%±4.98% vs 65.87%±10.32%)，這與S.Sart 等[14]使用慢速冷凍對胚胎干細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行低溫保存，復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)的存活率65%～68%的結(jié)果近似。培養(yǎng)至第3 天時細(xì)胞微團(tuán)增殖率之間無顯著差異(15.94%±2.00% vs 15.87%±2.09%)，明顯低于新鮮組細(xì)胞微團(tuán)的增殖率。

圖3 慢速冷凍肺癌細(xì)胞微團(tuán)AO/PI 染色圖像Fig.3 AO/PI staining image of cell spheroids after slow-freezing

表1 慢速冷凍細(xì)胞微團(tuán)相對活力及3 天增殖率Tab.1 Relative viability and 3-day proliferation rate of cell spheroids after slow-freezing

2.4 塑料麥管冷凍肺癌細(xì)胞微團(tuán)

使用塑料麥管作為冷凍載體，不同濃度低溫保護(hù)劑低溫保存細(xì)胞微團(tuán)的存活率結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，使用VS1 低溫保護(hù)劑，細(xì)胞微團(tuán)中存在大量晚期凋亡或死亡細(xì)胞；使用VS2、VS3 低溫保護(hù)劑，細(xì)胞微團(tuán)中只有少量死亡細(xì)胞，低溫保存效果明顯好于VS1。使用不同濃度低溫保護(hù)劑低溫保存細(xì)胞微團(tuán)的活力以及增殖能力的結(jié)果見表2。使用VS2、VS3低溫保護(hù)劑時，細(xì)胞微團(tuán)相對活力無顯著差異，且明顯高于VS1。培養(yǎng)至第3 天時，使用VS2 低溫保護(hù)劑組的細(xì)胞微團(tuán)增殖能力與新鮮組細(xì)胞微團(tuán)的增殖率相比無顯著性差異，顯著高于使用VS1、VS3 組細(xì)胞微團(tuán)的增殖率。

圖4 塑料麥管冷凍肺癌細(xì)胞微團(tuán)AO/PI 染色圖像Fig.4 AO/PI staining image of cell spheroids frozen with plastic straw

表2 使用冷凍麥管冷凍細(xì)胞微團(tuán)相對活力及3 天增殖率Tab.2 Relative viability and 3-day proliferation rate of cell spheroids frozen with plastic straw

2.5 玻璃毛細(xì)管冷凍肺癌細(xì)胞微團(tuán)

使用玻璃毛細(xì)管作為冷凍載體，使用不同濃度低溫保護(hù)劑低溫保存細(xì)胞微團(tuán)存活率的結(jié)果見圖5?？梢钥闯?，使用VS1 低溫保護(hù)劑，細(xì)胞微團(tuán)中存在較多的晚期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞，使用VS2 低溫保護(hù)劑，細(xì)胞微團(tuán)中只有少量死亡細(xì)胞，或處于早期凋亡狀態(tài)細(xì)胞；而使用VS3 作為低溫保護(hù)劑時，細(xì)胞微團(tuán)中的活細(xì)胞比例最高，說明VS3 的低溫保存效果優(yōu)于使用VS2、VS1。使用不同濃度低溫保護(hù)劑低溫保存細(xì)胞微團(tuán)的活力以及增殖能力的結(jié)果見表3。使用VS3 低溫保護(hù)劑時，細(xì)胞微團(tuán)相對活力及3 天增值率與新鮮對照組無顯著差異，且明顯高于VS1、VS2 組。

圖5 玻璃毛細(xì)管冷凍肺癌細(xì)胞微團(tuán)AO/PI 染色圖像Fig.5 AO/PI staining image of cell spheroids frozen with glass capillary

表3 使用玻璃毛細(xì)管冷凍細(xì)胞微團(tuán)相對活力及3 天增殖率Tab.3 Relative viability and 3-day proliferation rate of cell spheroids frozen with glass capillary

2.6 不同冷凍方法的對比

從上述低溫保存方案中，選擇復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)活力較高及增值率較高的幾組進(jìn)行對比，不同低溫保存方案相對新鮮細(xì)胞微團(tuán)活力結(jié)果見圖6，不同低溫保存方案以及新鮮細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)3 天增殖率見圖7。

圖6 不同低溫保存方案細(xì)胞微團(tuán)相對新鮮細(xì)胞微團(tuán)活力Fig.6 The relative viability of cell spheroids under different cryopreservation schemes

圖7 不同低溫保存方案下細(xì)胞的增殖能力Fig.7 Cell proliferation ability under different cryopreservation schemes

由圖6 和圖7 可知，上述低溫保存方案中，慢速冷凍復(fù)蘇后的細(xì)胞微團(tuán)活力相對較差，增殖能力相對較差，不同慢速冷凍體系對于低溫保存后細(xì)胞微團(tuán)相對活力、增殖能力無顯著性差異。使用冷凍載體直接浸入液氮低溫保存的細(xì)胞微團(tuán)活力及增殖能力均優(yōu)于慢速冷凍組，其中使用玻璃毛細(xì)管作為冷凍載體，VS3 溶液作為低溫保護(hù)劑時，復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)相對新鮮組細(xì)胞微團(tuán)活力最高為94.59%，增殖能力與新鮮組細(xì)胞微團(tuán)差異最小。這與Li Tao 等[15]使用直接接觸液氮的玻璃化方法對胚胎干細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行低溫保存，復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)的存活率為94.3%的結(jié)果近似。

2.7 肺癌細(xì)胞微團(tuán)快速及玻璃化凍存的熱力學(xué)分析

在使用塑料麥管和玻璃毛細(xì)管作為冷凍載體對細(xì)胞微團(tuán)進(jìn)行快速冷凍時，低溫保存效果優(yōu)于使用程控降溫儀及程序降溫盒組的慢速冷凍，這與冷凍載體可實(shí)現(xiàn)的降溫速率及低溫保護(hù)劑的玻璃化轉(zhuǎn)變臨界降溫速率有關(guān)。

使用塑料麥管和玻璃毛細(xì)管作為冷凍載體，對兩種冷凍載體加載低溫保護(hù)劑直接浸入液氮的溫度變化進(jìn)行采集，并繪制溫度變化曲線，兩種冷凍載體加載低溫保護(hù)劑降溫過程溫度變化如圖8所示。通過對有效降溫區(qū)間(－140～0 ℃)計(jì)算，塑料麥管的降溫速率為(2 207.04 ± 191.76)℃/min。玻璃毛細(xì)管的降溫速率為(4 712.07 ± 143.44)℃/min。

圖8 冷凍載體加載保護(hù)劑降溫過程溫度變化Fig.8 Temperature curve of the carrier loaded with cryoprotectant during cooling process

觀察塑料麥管和玻璃毛細(xì)管兩種冷凍載體加載低溫保護(hù)劑后直接插入液氮的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)浸入液氮后VS1 溶液出現(xiàn)明顯結(jié)晶，VS2、VS3 溶液未出現(xiàn)結(jié)晶。這說明塑料麥管的降溫速率(2 207.04± 191.76)℃/min、玻璃毛細(xì)管的降溫速率(4 712.07± 143.44)℃/min 都未超過VS1 溶液的玻璃化臨界降溫速率，VS1溶液在這兩種凍存體系中并未實(shí)現(xiàn)玻璃化只實(shí)現(xiàn)了快速冷凍?？焖倮鋬鰰r，由于降溫速率較快，細(xì)胞內(nèi)的水分來不及被低溫保護(hù)劑置換出來，導(dǎo)致細(xì)胞微團(tuán)不能及時失水，細(xì)胞內(nèi)外均形成大量冰晶，使細(xì)胞內(nèi)溶液過冷，快速生長為大冰晶，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成間接損傷，破壞細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，甚至引起細(xì)胞膜、細(xì)胞器受損，導(dǎo)致復(fù)溫后細(xì)胞微團(tuán)的活力和功能性受到影響。

對不同降溫速率下VS2 溶液的量熱學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如表4所示。由式(3)～式(5)可計(jì)算出VS2溶液的臨界降溫速率為(269.82±37.54)℃/min。

表4 VS2 溶液的量熱學(xué)數(shù)據(jù)Tab.4 Calorimetric data of VS2 solution

對不同降溫速率下VS3 溶液的量熱學(xué)分析表明，隨著降溫速率的降低，60 ℃/min、30 ℃/min、15℃/min、5 ℃/min、2 ℃/min，直到降溫速率為2 ℃/min，VS3 溶液在降溫過程中DSC 仍然無法檢測到放熱現(xiàn)象，說明VS3 的臨界降溫速率< 2 ℃/min。

由于塑料麥管可實(shí)現(xiàn)的降溫速率為(2 207.04 ±191.76)℃/min、玻璃毛細(xì)管可實(shí)現(xiàn)的降溫速率為(4 712.07±143.44)℃/min，二者均遠(yuǎn)高于VS2、VS3 玻璃化臨界降溫速率，說明VS2、VS3 溶液在降溫階段實(shí)現(xiàn)了玻璃化。雖然VS2、VS3 溶液在塑料麥管和玻璃毛細(xì)管兩種冷凍載體中都實(shí)現(xiàn)了玻璃化，但是由于玻璃毛細(xì)管傳熱性能好于塑料麥管且吸液量遠(yuǎn)小于塑料麥管，因此玻璃毛細(xì)管的降溫速率高于塑料麥管，使用玻璃毛細(xì)管作為冷凍載體，VS3 溶液作為低溫保護(hù)劑，降溫過程中形成的玻璃化程度更高。

玻璃化冷凍與慢速冷凍的主要差異在于冷凍速度與冷凍保護(hù)劑的體積濃度不同。相比于慢速冷凍[20]，玻璃化冷凍需要超快速的降溫速率使降溫過程中液體不發(fā)生結(jié)晶現(xiàn)象，由于在降溫過程中細(xì)胞內(nèi)外的水分子迅速度過相變溫區(qū)，避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，保持了細(xì)胞微團(tuán)較好的活性以及結(jié)構(gòu)的完整性并保持了良好增殖能力。此外，玻璃化冷凍需要高濃度的低溫保護(hù)劑，高濃度低溫保護(hù)劑通過降低溶液的凝固點(diǎn)和提高溶液黏度來促進(jìn)玻璃化的實(shí)現(xiàn)，同時保護(hù)劑體積濃度高，滲透壓較大可加快跨膜傳質(zhì)。VS3溶液相比于VS1、VS2 溶液濃度最大，滲透壓最高，在相同的平衡時間內(nèi)低溫保護(hù)劑跨膜運(yùn)輸更快，細(xì)胞微團(tuán)內(nèi)部保護(hù)劑濃度越高，且短時間的平衡時間細(xì)胞受到的毒性損傷較小。但同時低溫保護(hù)劑自身毒性也大，因此只有在較短的平衡時間保證滲透充分且充分洗脫才可避免低溫保護(hù)劑對細(xì)胞微團(tuán)的毒性損傷。

3 總結(jié)

本文研究了A549 肺癌細(xì)胞的接種密度以及培養(yǎng)天數(shù)對細(xì)胞微團(tuán)尺寸及生長狀態(tài)的影響，得到如下結(jié)論:

1)細(xì)胞接種密度為2×104個/mL，培養(yǎng)3 天的細(xì)胞微團(tuán)狀態(tài)良好，尺寸約300～400 μm，適用于低溫保存。

2)使用程序降溫盒、程控降溫儀兩種慢速冷凍法低溫保存肺癌細(xì)胞微團(tuán)，復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)活力相對新鮮組細(xì)胞微團(tuán)活力為69.36%和65.87%，3 天增殖率分別為15.94%和15.87%，遠(yuǎn)低于新鮮組細(xì)胞微團(tuán)增殖能力。

3)使用塑料麥管和玻璃毛細(xì)管快速或玻璃化保存肺癌細(xì)胞微團(tuán)，當(dāng)采用玻璃毛細(xì)管為冷凍載體，以含有20%EG ＋20%Me2SO ＋0.5 mol/L 海藻糖的DMEM 作為低溫保護(hù)劑時，復(fù)蘇后細(xì)胞微團(tuán)相對新鮮組活力為94.59%±9.23%，3 天增殖率與新鮮組最為接近。

4)熱力學(xué)分析表明塑料麥管和玻璃毛細(xì)管可實(shí)現(xiàn)的降溫速率分別為(2 207.04±191.76)℃/min 和(4 712.07±143.44)℃/min，未達(dá)到VS1 溶液的玻璃化臨界降溫速率，而高于VS2、VS3 玻璃化臨界降溫速率，因此VS1 溶液在這兩種凍存體系中是快速冷凍，而VS2、VS3 溶液在兩種凍存體系中可以實(shí)現(xiàn)玻璃化。