李慧芳，桂 敏，張萍萍，張美玲，李永忠，劉雅婷

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學 煙草學院，云南 昆明 650201)

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)屬于番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)[1]，于1915 年在澳大利亞首次被發(fā)現(xiàn)[2]。其寄主范圍廣泛，可侵染80 多科1 000 多種植物[3-4]，在歐美、亞洲及大洋洲等多個地區(qū)廣泛分布，造成嚴重的經(jīng)濟損失[3,5-6]，已被列為世界十大農(nóng)業(yè)病害之一[7]。近年來，TSWV 在中國云南、貴州和廣西等地流行發(fā)生，嚴重危害當?shù)胤选⒗苯?、煙草和花卉等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展[4,8-9]。TSWV 是三分子基因組，包括L、M 和S 等 3 條RNA 鏈。S 鏈負鏈編碼核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)[4]，負責包裹病毒基因組RNA，參與病毒的多種生物學過程，其序列保守程度較高，作為本屬病毒分類的重要依據(jù)[10]。N 蛋白能夠與TSWV 的3個RNA 分子形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)[11]，且N 蛋白的單體之間可以互作形成N蛋白多聚體[12]，這一現(xiàn)象對于病毒RNPs 的組裝非常重要。N 蛋白在病毒RNA 合成的早期起關鍵作用，可能參與病毒基因組復制和轉(zhuǎn)錄[13]。有研究表明：N 蛋白與病毒在寄主體內(nèi)的長距離運輸有關[14-15]。它可在植物細胞內(nèi)形成高速運動的顆粒，并能夠通過與微絲馬達蛋白互作運動[16]。最新研究發(fā)現(xiàn)：在本氏煙上沉默N基因可使本氏煙抵抗TSWV[17]，但N基因在辣椒上的抗病研究還未見報道。

在植物宿主感染期間，病毒須克服宿主防御，RNA 沉默是一種高度保守的病毒防御機制。病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是一種快速沉默目的基因、鑒定基因功能的反向遺傳學新技術[18-19]，主要應用于植物的抗病基因以及與代謝和發(fā)育相關基因的研究[20]。目前，開發(fā)應用于VIGS 的病毒載體主要有三大類[20]，包括由RNA 病毒改造、由DNA 病毒改造和由衛(wèi)星病毒改造而來的載體。其中，煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)是目前使最廣泛的RNA 病毒載體[21]。TRV 因其在寄主上侵染后對寄主本身的影響較小[22]，已應用于茄子、棉花、煙草和番茄[21-24]等多種植物的基因功能研究。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS) 是類胡蘿卜素生物合成的關鍵酶，當類胡蘿卜素合成途徑被阻斷后，植物出現(xiàn)白化現(xiàn)象，常作為表型對照來監(jiān)測沉默效果[25-26]。本研究將TSWV 病毒的N基因構建到TRV 載體上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染辣椒后，通過qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)該載體可高效沉默N基因。該沉默載體的構建一方面可為TSWV 病毒N基因在致病等方面的研究提供前期依據(jù)，另一方面也為后續(xù)開展辣椒抗病基因分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TSWV (JC-1)毒源和易感TSWV 的辣椒(Capsicum annuumL.)湘研11 號種子均由本課題組保存；病毒載體pTRV1 和pTRV2 由云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院陳小姣惠贈。

1.2 總RNA 提取、目的基因擴增及克隆

采用TRNzol-A+(天根生化科技有限公司，北京)試劑盒提取樣品總RNA，利用Prime ScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (寶生物技術有限公司，大連)進行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。根據(jù)Gen-Bank 中公布的TSWV 的N基因序列(GenBank登錄號：JN664252.1)和辣椒的CaPDS基因序列(GenBank 登錄號：X68058)設計特異性引物(表1)。

表1 目的片段擴增引物Tab.1 Primers for amplification of target fragments

用Prime STAR?Max (寶生物工程有限公司，大連) 高保真DNA 聚合酶擴增目的片段，PCR 反應體系為：Prime STAR Max Premix (2×)25 μL、正向引物和反向引物各2.5 μL 以及cDNA 2.5 μL，補充滅菌蒸餾水至50 μL。PCR 反應條件：98 ℃ 20 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR 目的片段純化并用Tailing-A Reaction Kit 試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)進行加A 反應，反應體系為：經(jīng)純化的平末端DNA 片段15 μL、Tailing-A Reacton Buffer 4 μL、TaqDNA polymerase (2.5 U/μL) 1 μL；混勻后，72 ℃孵育30 min。加A 后的產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T 相連，熱擊法轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞(寶生物工程有限公司，大連)，涂板過夜培養(yǎng)，經(jīng)氨芐霉素(Ampicillin，100 mg/L)抗性和通用引物M13-47/48 擴增菌液PCR，篩選的陽性重組子送上海生工進行菌液測序。

1.3 沉默載體構建

將擴增得到的N基因和CaPDS基因PCR 產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI 和SacI [賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海]進行雙酶切，將雙酶切產(chǎn)物純化，用T4 DNA 連接酶連接到同樣用XbaI 和SacI 雙酶切的pTRV2 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用卡那霉素(Kanamycin，50 mg/L)的抗性條件和菌液PCR 篩選陽性重組子并測序驗證。

1.4 沉默體系的建立

將轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 的陽性重組子pTRV2-N和pTRV2-CaPDS提取質(zhì)粒。根據(jù)農(nóng)桿菌GV3101 (吐露港生物科技有限公司，上海)說明書，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，并在卡那霉素(50 mg/L)和利福平霉素(Rifampicin，25 mg/L)抗性條件下篩選轉(zhuǎn)化子。分別培養(yǎng)含有pTRV2-CaPDS、pTRV2-N和pTRV1 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV-3101，各取菌液1 mL 加入20 mL 的YEB 培養(yǎng)基(含25 mg/L 利福平和50 mg/L 卡那霉素)中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，28 ℃，過夜。離心收集菌體，加入侵染液(含10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和200 μmol/L 乙酰丁香酮)懸浮菌體，調(diào)整菌液OD600至1.0 左右，暗處孵育4～6 h，為注射侵染做準備。

取等體積的 pTRV1 農(nóng)桿菌重懸液與空病毒載體 pTRV2 農(nóng)桿菌重懸液充分混合，作為陰性對照；取等體積的 pTRV1 農(nóng)桿菌重懸液與重組病毒載體 pTRV2-CaPDS農(nóng)桿菌重懸液充分混合，作為陽性對照；取等體積的pTRV1 農(nóng)桿菌重懸液與重組病毒載體pTRV2-N農(nóng)桿菌重懸液充分混合，作為試驗組，用于注射侵染。以在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至2～4 葉期的辣椒幼苗為待侵染材料，每組10 株，用一次性無針頭1 mL 注射器對幼苗葉背部進行注射侵染[27]。注射侵染前可先輕微制造創(chuàng)傷，再將菌液注射進辣椒幼嫩葉片背部；葉片經(jīng)注射侵染后可觀察到明顯的圓形水漬狀痕跡。侵染后的植株置于22 ℃、濕度50%和光周期L∶D=16 h∶8 h 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待注射了pTRV2-CaPDS的辣椒植株心葉出現(xiàn)白化現(xiàn)象后，開始對注射pTRV2 菌液(陰性對照)和pTRV2-N菌液(試驗組) 的植株分別機械摩擦接種TSWV。同時以不做任何處理的健康植株為空白對照，只接種TSWV 且不注射任何載體菌液的植株為陽性對照。在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察辣椒的表型變化。采集顯癥樣品進行沉默效率檢測。

1.5 qRT-PCR

所采樣品植物總RNA 按照TRNzol-A+提取試劑盒說明進行操作。用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) (諾唯贊生物科技有限公司，南京)合成cDNA。Actin(GenBank登錄號：XM_016722297.1)設計內(nèi)參基因，設置3 個平行試驗，qRT-PCR 引物使用Primer Premier 6.0 軟件設計(表2)。用ABI 7500 PCR 儀，參照SuperReal Premix Plus (SYBR Green)試劑盒(天根生化科技，北京) 說明書進行。反應體系為：cDNA 1 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，2×SYBR?Green Super mix 5 μL，ddH2O 3 μL；反應程序為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。

表2 實時熒光定量引物Tab.2 Primers for qRT-PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用2-ΔΔCt法計算各個樣品的基因相對表達量，試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010 進行統(tǒng)計，SPSS 26.0 對所有數(shù)據(jù)在P＜0.01 水平上進行Duncan’s多重比較差異顯著性分析，應用Origin 2019b 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒總RNA 的提取和鑒定

由圖1 可知：辣椒葉片的總RNA 電泳結(jié)果可觀察到明亮完整的3 條帶，說明提取的辣椒總RNA 完整，可用于后續(xù)試驗。

圖1 辣椒葉片總RNAFig.1 Total RNAs of pepper

2.2 辣椒 PDS 基因和TSWV N 基因片段克隆及序列分析

pMD18-T 空載體通用引物M13-47 和M13-48 可擴增130 bp 的條帶；與目的片段CaPDS連接后，片段長度應該為520 bp；與目的片段N連接后，片段長度應該為355 bp。觀察瓊脂糖凝膠電泳圖(圖2)發(fā)現(xiàn)：在500～750 bp 和250～500 bp之間分別有1 條清晰條帶。結(jié)合測序結(jié)果可知：目的基因CaPDS片段長度為390 bp，目的基因N片段長度為225 bp，片段大小與預期結(jié)果一致，且陰性對照沒有擴增出條帶。將驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-CaPDS和pMD18-TN，可用于下一步試驗。

圖2 目的基因pMD18-T 載體片段擴增Fig.2 Target gene pMD18-T vector fragment amplification

2.3 成功獲得TSWV N 基因和辣椒CaPDS 基因的病毒沉默載體

所獲得的重組沉默載體結(jié)構如圖3 所示。pTRV2 載體中的2 個花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S 啟動子(2×35S)和胭脂堿合酶終止子(nopaline synthase terminator，N)之間的多克隆位點處是已連接的帶有XbaI 和SacI 雙酶切位點的目的基因片段(CaPDS基因和N基因)。

圖3 目的基因重組病毒載體的結(jié)構Fig.3 Structure of recombinant viral vector of target gene

由圖4 可知：重組病毒載體擴增結(jié)果與目的基因片段的序列完全一致，說明成功構建病毒N基因的病毒沉默載體pTRV2-N和辣椒CaPDS基因的病毒沉默載體pTRV2-CaPDS，可以用于侵染辣椒植株。

圖4 目的基因TRV 病毒載體片段擴增Fig.4 Target gene TRV viral vector fragment amplification

2.4 辣椒接種重組TRV 沉默載體后的表型分析

CaPDS基因作為陽性對照，作為沉默成功的表型指示，當沉默辣椒CaPDS基因后，植株的葉片就會受到光的漂白而呈現(xiàn)白色。侵染3 周，觀察發(fā)現(xiàn)接種重組pTRV2-CaPDS病毒載體的植株葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象(圖5)，隨著接種時間的延長白化癥狀會越加明顯。其中接種pTRV2 空載體的陰性對照組辣椒植株無癥狀，說明空載體對辣椒表型無影響。從白化表型上也可說明TRV病毒誘導的基因沉默載體在辣椒中構建成功。

圖5 沉默辣椒CaPDS 的白化表型Fig.5 Albino phenotype of CaPDS silenced pepper plants

3 周左右，先接種含pTRV1 和空病毒載體侵染菌液后接種TSWV 的辣椒植株在其新葉及老葉上可觀察到明顯的褪綠、黃化斑、皺縮和壞死斑癥狀。而先接種含有pTRV1 和pTRV2-N沉默載體侵染菌液后接種TSWV 病毒的辣椒植株，其新葉無癥狀，老葉觀察到葉片尖部畸形(圖6)。結(jié)果表明注射pTRV2-N沉默載體的辣椒植株對TSWV表現(xiàn)出一定抗性。

圖6 TSWV 侵染N 基因沉默后的辣椒表型Fig.6 Phenotype of pepper infected by TSWV after N gene silencing

2.5 接種辣椒的TSWV N 基因表達水平分析

由圖7 可知：接種了含pTRV2 空病毒載體的對照組和試驗組中N基因的表達量存在較大差異。辣椒N基因沉默體系在接種TSWV 后與對照組相比，被TSWV 侵染的葉片中N基因表達量極顯著降低，僅為對照組的6.79%±2.56% (P＜0.01)。說明辣椒N基因沉默體系可以高效沉默接種到辣椒植株上的TSWV 病毒的N基因，同時也在分子水平上說明由TRV 病毒介導的N基因沉默體系在辣椒上有效。

圖7 TSWV N 基因的相對表達量Fig.7 Relative expression of TSWV N gene

3 討論

TSWV 在全球范圍內(nèi)廣泛分布，一般發(fā)生在溫帶地區(qū)和亞熱帶地區(qū)，已成為侵染農(nóng)作物和花卉最嚴重的病原之一。研究表明：TSWV 在云南以逐年上升的趨勢快速擴張[28]，從海拔300 m 的熱帶氣候到海拔3 000 m 的寒帶氣候均有分布[29]。目前的農(nóng)業(yè)防治和物理防治方法不能長期有效控制TSWV 的蔓延，而施用過多的化學藥劑也對生態(tài)環(huán)境造成嚴重威脅。辣椒抗病資源的篩選和抗病品種的選育一直是防控TSWV 的重要途徑[30]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)辣椒抗TSWV 的材料有PI159236、PI15-2225、CNPH275、7 204、PI15 和C00943 等[31-35]。王立浩等[36]利用種間雜交和分子標記輔助回交選育方法將PI152225 中的Tsw基因轉(zhuǎn)到中椒系列骨干親本一年生辣椒 (C.annuumL.) 大果甜椒自交系0516 中，選育出抗TSWV 的辣椒品種0516。但由于Tsw是單顯性基因遺傳，TSWV 突變株系不斷產(chǎn)生，尋找廣譜抗性基因和培育抗性持久的抗病資源是今后育種工作的重要方向[37-39]。VIGS技術作為一種能快速分析植物目標基因功能的方法，已經(jīng)成功運用在辣椒部分功能基因的研究中[27]，但目前以辣椒為寄主沉默外源的病毒基因研究其抗性鮮有報道。TRV 是單鏈RNA 病毒，基因組由RNA1 和RNA2 兩部分組成，經(jīng)改造過的RNA1 (pTRV1)攜帶病毒復制和轉(zhuǎn)運所必需的基因，RNA2 (pTRV2)編碼必要的病毒外殼蛋白。在TRV-VIGS 體系中，目標基因序列通常被連接到pTRV2 多克隆位點上[40]。本研究成功構建了TSWVN基因的沉默載體pTRV2-N。利用農(nóng)桿菌注射接種辣椒湘研11，3 周后觀察發(fā)現(xiàn)辣椒新葉無癥狀，老葉葉片尖部出現(xiàn)畸形，這種現(xiàn)象可能是因為VIGS 引起的沉默在靠近生長點的部位效果最佳[21]，且通常不能完全抑制目的基因的表達[19]。與未接種N基因沉默載體的對照組相比，N基因的表達量僅為對照組的6.79%，該沉默載體可高效沉默N基因，使得易感TSWV病毒的辣椒品種湘研11 對TSWV 有抗性。為后續(xù)從分子層面通過基因沉默技術對辣椒相關抗病基因功能的驗證提供了高效的技術平臺。目前VIGS 系統(tǒng)仍存在一些問題，如在植株各個部位的目標基因沉默不徹底、沉默效率不一致[41]等，可通過對體系的優(yōu)化和增加試驗重復等來克服[17]。隨著高通量測序技術的快速發(fā)展，大量未知基因被發(fā)現(xiàn)。VIGS 技術簡單快捷，有望成為鑒定大量基因功能的主要工具[42]。VIGS 技術中的主要成分是雙鏈RNA，它在生物中普遍存在，在自然環(huán)境中也易降解，無毒，殘留時間短，是一種綠色環(huán)保的抗病蟲技術，對作物病蟲害綠色防控也有巨大的應用前景[43-44]。

4 結(jié)論

本研究利用VIGS-TRV 病毒載體構建了TSWV 病毒基因沉默體系。利用該體系可高效沉默TSWVN基因；結(jié)合表型及基因表達水平分析，沉默TSWVN基因后辣椒對入侵的TSWV產(chǎn)生一定的抗性。同時，該體系可為后續(xù)病毒致病機制的研究提供依據(jù)。