王若焱，華 萃，檀龍顏，王道平，張 忠，吳月君

（1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽(yáng) 550025；2遵義金喜農(nóng)業(yè)科技有限公司，貴州遵義 563000；3貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550000）

0 引言

太子參是常用中藥材，為石竹科植物孩兒參(Pseudostellariaheterophylla)的干燥塊根，具有益氣生津、健脾潤(rùn)肺的功效[1]。太子參主產(chǎn)于福建、江蘇、貴州、安徽、浙江等省，在中國(guó)有近百年的栽培歷史[2-3]。貴州省作為四大藥材產(chǎn)區(qū)之一，引進(jìn)栽培太子參已有20余年[4]，其中施秉縣因種植面積大、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)而擠身于全國(guó)太子參藥材市場(chǎng)的生產(chǎn)大縣[5]。然而長(zhǎng)期以來(lái)，太子參均以塊根進(jìn)行繁殖，使太子參種源易退化，感病率增加，最終導(dǎo)致產(chǎn)量以及品質(zhì)的下降[6-8]。其中病毒病在太子參病害尤為常見(jiàn)[9]，馬鈴薯Y病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、蕪菁花葉病毒等為目前已有病毒種類，發(fā)病率高達(dá)80%～90%[10-11]。田間調(diào)查表明貴州施秉種植區(qū)太子參病毒病一般5月初達(dá)到病害高發(fā)期，已成為制約施秉縣太子參生產(chǎn)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸之一[12-13]。

然而太子參病毒病的防治缺乏登記用藥，盲目用藥現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，對(duì)太子參生產(chǎn)安全和質(zhì)量安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅?；瘜W(xué)方法對(duì)于太子參病毒病防效有一定的效果，但僅起到一定的預(yù)防作用或在發(fā)病初期得到控制，病毒病發(fā)生后防治效果甚微[14-15]。國(guó)內(nèi)藥用植物資源廣泛，能夠產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過(guò)20萬(wàn)種，是生物活性化合物的天然寶庫(kù)，其中包含了大量的能控制病毒病的有效成分，既環(huán)保又無(wú)毒副作用[16]。前人研究表明從植物中提取的活性物質(zhì)如多糖類、蛋白類等本身雖然對(duì)病原菌沒(méi)有明顯抑制作用，但可以增強(qiáng)栽培作物的免疫能力，從而達(dá)到抗菌抗病毒的作用[17]。中藥復(fù)方是指由兩味或兩味以上藥用植物組成，通過(guò)特定的加工方法，針對(duì)相對(duì)確定的病癥而設(shè)的方劑，是中醫(yī)方劑的主體組成部分。結(jié)合中醫(yī)“整體觀”、“未病先防”、“整體辯證施治”的理論，將中藥復(fù)方的觀點(diǎn)運(yùn)用于植物，增強(qiáng)目標(biāo)植物自身免疫能力，從而能夠很好地抵抗病毒侵染。課題組前期以金銀花、青蒿為主要原料的中藥復(fù)方抑菌劑發(fā)現(xiàn)對(duì)煙草青枯病、白粉病、炭疽病、黑脛病、根黑腐病的病原菌具有體外直接抑菌效果，而大田試驗(yàn)表明抑菌劑能有效預(yù)防烤煙土傳病害發(fā)生，降低病毒病危害程度，產(chǎn)值比對(duì)照提高近30%。但目前中藥復(fù)方應(yīng)用于太子參病毒病的防治研究較少，研發(fā)有效的配方是系統(tǒng)性緩解太子參病毒病的新途徑，在作物領(lǐng)域跨界運(yùn)用中藥復(fù)方解決太子參生態(tài)系統(tǒng)瓶頸問(wèn)題具有廣闊前景。

因此，本研究為探索太子參病毒病防治的理想藥劑，降低危害損失，確保太子參優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，以可提高作物抗逆性及產(chǎn)質(zhì)量的中藥復(fù)方抑菌水提物為切入點(diǎn)，并根據(jù)文獻(xiàn)記載有抗病活性的藥材為組方，通過(guò)太子參大田種植條件下小區(qū)試驗(yàn)，考察在病毒病自然發(fā)病情況下，各抑菌復(fù)配劑處理對(duì)太子參病毒病的防效，同時(shí)觀察各處理對(duì)太子參產(chǎn)量、太子參總多糖及環(huán)肽B等指標(biāo)的影響，篩選出防治病毒病的最優(yōu)配方，以期獲得一藥多效、高效安全的太子參病毒病防治技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 抑菌劑制備及主要化學(xué)成分

復(fù)配劑總液（試驗(yàn)中抑菌劑1號(hào)，下同）藥材以金銀花、青蒿為主要原料。各原料由貴州省遵義市藥材市場(chǎng)購(gòu)得。購(gòu)買后由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥材外觀性狀鑒定。本實(shí)驗(yàn)將復(fù)配劑制成浸膏，采用試管法和薄層法對(duì)復(fù)配劑水煎劑浸膏化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別，明確復(fù)配劑中含有的大類成分和部分單體成分。

1.2 田間試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)及農(nóng)事操作

試驗(yàn)?zāi)攴轂?018年，試驗(yàn)地為施秉縣優(yōu)匹克生態(tài)發(fā)展有限公司太子參基地（27°08′24.49″N，107°55′33.43″E，海拔937.01 m），選擇太子參連作2年地塊進(jìn)行。各處理統(tǒng)一采用本草中藥復(fù)方土壤改良有機(jī)肥1200 kg/hm2（2017年在茶葉和草莓等作物上經(jīng)過(guò)小區(qū)試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)施肥組合，由中藥復(fù)方原粉與米糠炒制而成）。

1.3 抑菌劑配方篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置5個(gè)處理3個(gè)重復(fù)小區(qū)試驗(yàn)，分為以青蒿為主藥進(jìn)行組方加減的形成抑菌劑1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)，以及抑菌劑+驅(qū)蟲劑+抗病毒劑形成的混合液。設(shè)置噻菌銅（防治細(xì)菌性病害）、烯酰嗎啉（防治真菌性病害）聯(lián)用為化學(xué)藥劑對(duì)照（表1）。本試驗(yàn)處理替代常規(guī)藥劑，全生育期施用6次，其余生產(chǎn)措施同常規(guī)生產(chǎn)。

表1 中藥復(fù)方抑菌劑配方篩選田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 復(fù)方病毒防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置4個(gè)處理3個(gè)重復(fù)小區(qū)試驗(yàn)，將從1.3試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)抑菌劑抗病復(fù)方水劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用，對(duì)病毒性病害進(jìn)行聯(lián)合防治，觀察不同聯(lián)用處理對(duì)太子參病毒病發(fā)生的統(tǒng)防效果。以噻菌銅（防治細(xì)菌性病害）+烯酰嗎啉（防治真菌性病害）+嗎啉胍乙酸銅+氨基寡糖素作為化學(xué)藥劑對(duì)照。本試驗(yàn)處理替代常規(guī)藥劑，全生育期施用6次，其余生產(chǎn)措施同常規(guī)生產(chǎn)（表2）。

表2 中藥復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用效應(yīng)田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5 病害調(diào)查及分析方法

1.5.1 病害調(diào)查方法 在太子參生育期，于5月初開(kāi)始病害發(fā)生高峰期調(diào)查病毒病及葉斑病發(fā)病率。病害調(diào)查時(shí)，每小區(qū)隨機(jī)取40株太子參，調(diào)查每個(gè)處理小區(qū)的病葉數(shù)，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，如式(1)～(3)。病毒病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病新芽葉片；1級(jí)，病毒病新芽葉片卷曲程度和斑斕狀占全葉的5%以下；3級(jí)，病毒病新芽葉片卷曲程度和斑斕狀占全葉的6%～25%；5級(jí)，病毒病新芽葉片卷曲程度和斑斕狀占全葉的26%～50%；7級(jí)，病毒病新芽葉片卷曲程度和斑斕狀占全葉的51%以上。葉斑病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑占全葉5%以下；3級(jí)，病斑占全葉6%～25%；5級(jí)，病斑占全葉26%～50%；7級(jí)，病斑占全葉51%以上。

1.5.2 統(tǒng)計(jì)分析方法 統(tǒng)計(jì)分析采用Excel；方差分析采用SPSS(version 22.0，SPSS Institute,Inc.)。

1.6 農(nóng)事操作

1.6.1 施用方法 所有處理在太子參大田生長(zhǎng)期間采用淋根及葉面噴霧的方式施用3次和5次。先噴霧葉面至有可見(jiàn)水霧附著葉面后，去掉噴頭，將噴管對(duì)準(zhǔn)植株頂部，淋根6～8 s，使藥劑順植株流入根系土壤。小苗時(shí)可直接用噴霧器將葉面與根部同時(shí)噴淋。

1.6.2 施用劑量 化學(xué)藥劑根據(jù)商品說(shuō)明推薦劑量溶解在15 L（1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)噴霧器容量）清水中。移栽后大田15天后進(jìn)行第一次噴施。每畝太子參施用1壺標(biāo)準(zhǔn)溶劑（標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)15 L噴霧器）。移栽后30天及50天施用第二次及第三次。每隔7天噴施1次，采收前30天停止噴藥，太子參全生育期約噴施6次。

1.7 檢測(cè)方法

方法參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌復(fù)配劑總液進(jìn)行主要化學(xué)成分檢驗(yàn)

復(fù)配劑總黃酮的平均含量為255.3 mg/g(n=6)，總生物堿的平均含量為17.5 mg/g(n=6)，總木質(zhì)素的平均含量為177.0 mg/g(n=6)，總有機(jī)酸的平均含量為211.2 mg/g(n=6)（表3）。由表3可知，復(fù)配劑不同極性部位中總黃酮含量＞總木質(zhì)素含量＞總生物堿含量；正丁醇層和水層中總黃酮的含量最高分別為24.5、21.0 mg/g，水層中木質(zhì)素含量最高為10.4 mg/g，正丁醇層中生物堿含量最高為3.4 mg/g。

表3 1號(hào)復(fù)方抑菌劑不同極性部位定量測(cè)定結(jié)果 mg/g

2.2 不同抑菌劑配方篩選田間試驗(yàn)

因在病害調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌性病害發(fā)生率小于2%，故只觀察和分析病毒病指標(biāo)。

2.2.1 對(duì)病毒病防效的影響 2018年5月10日對(duì)大田各試驗(yàn)進(jìn)行病害調(diào)查，大田太子參發(fā)生病毒病，未見(jiàn)其他病害。5月11日采用表1～2中處理對(duì)連作地太子參進(jìn)行定期預(yù)防，全生育期共計(jì)施用6次。截至6月中旬施用3次后5天調(diào)查，抑菌劑1號(hào)處理太子參病毒病發(fā)生率比對(duì)照降低82.2%(P＜0.01)，病指比對(duì)照降低14.7倍，抑菌劑1號(hào)防效最高(93.0%，P＜0.01)，其防效比抑菌劑2號(hào)提高20.7%；防效第二名的處理為抑菌劑3號(hào)處理，防效為91.8%(P＜0.01)。說(shuō)明抑菌劑1號(hào)及3號(hào)施用3次后，對(duì)太子參病毒病也具有較好防控作用，其余2個(gè)抑菌劑配方對(duì)病毒病防效均超過(guò)70%（表4）。

表4 2018年不同太子參病害防治復(fù)方水劑對(duì)病毒病防效比較

2.2.2 對(duì)產(chǎn)量的影響 抑菌劑3號(hào)及1號(hào)對(duì)產(chǎn)量提升作用顯著，產(chǎn)量分別比對(duì)照提高了69.57%及41.3%(P＜0.05)。抑菌劑4號(hào)對(duì)產(chǎn)量也有提升作用（提高13.4%，P＜0.05）。抑菌劑2號(hào)對(duì)太子參產(chǎn)量提升作用不明顯（表5）。

表5 不同抑菌劑配方處理對(duì)太子參產(chǎn)量的影響

2.2.3 對(duì)品質(zhì)的影響 由表6可知，抑菌劑1號(hào)、3號(hào)及4號(hào)對(duì)太子參總多糖及環(huán)肽B含量具有較好提升作用。其中抑菌劑1號(hào)對(duì)總多糖提升效果最好（提高51.00%）；抑菌劑3號(hào)對(duì)環(huán)肽B含量提高效果最好（提高52.00%）。

表6 不同抑菌劑配方處理對(duì)太子參總多糖及環(huán)肽B含量的影響 %

2.3 中藥復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用效應(yīng)試驗(yàn)

2.3.1 對(duì)病毒病的防效 調(diào)查時(shí)間及方法同上。由表7可見(jiàn)，由以上試驗(yàn)優(yōu)選出的各處理在治療太子參病毒病上具有極為顯著防效，除了化學(xué)藥劑單用以外，其他處理對(duì)病毒病防效均超過(guò)95.00%，其中防效最好的是1號(hào)抑菌劑+1號(hào)抗病毒劑(99.40%，P＜0.01)，以及與化學(xué)藥劑聯(lián)用99.50%(P＜0.01)。且抑菌劑與其他藥劑組合的處理（1號(hào)抑菌劑+化學(xué)藥劑及1號(hào)抑菌劑單用）對(duì)病毒病均具有較好防效（98.20%及96.50%，P＜0.01）。但各處理發(fā)病率、病情指數(shù)及防效未達(dá)到顯著性差異。

表7 復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用效應(yīng)試驗(yàn)處理對(duì)病毒病防效的影響

2.3.2 對(duì)產(chǎn)量的影響 與病毒病防效效果相同，1號(hào)抑菌劑+1號(hào)抗病毒劑及與化學(xué)藥劑聯(lián)用2個(gè)處理產(chǎn)量均比對(duì)照提高了1倍，對(duì)產(chǎn)量提升作用顯著(P＜0.05)。1號(hào)抑菌劑+化學(xué)藥劑與1號(hào)抑菌劑單用均對(duì)產(chǎn)量也有顯著提升作用（提高65%，P＜0.05）（表8）。

表8 復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用處理對(duì)產(chǎn)量的影響

2.3.3 對(duì)品質(zhì)的影響 在有機(jī)級(jí)別病害防治制劑中，1號(hào)抑菌劑+1號(hào)抗病毒劑對(duì)太子參總多糖含量提高效果最好，提高了15%；對(duì)提高環(huán)肽B含量效果最好，提高了12%。其中1號(hào)抑菌劑單用對(duì)總多糖含量也有提升效果，提高了4%，環(huán)肽B含量提高了12%。在綠色級(jí)別病害防治組合中，1號(hào)抑菌劑+1號(hào)抗病毒劑+化學(xué)藥劑對(duì)品質(zhì)也有提升作用，分別提高總多糖含量5%及8%。單用化學(xué)藥劑對(duì)品質(zhì)有影響，總糖降低6%（表9）。

表9 復(fù)方病害防治制劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用處理對(duì)品質(zhì)的影響 %

3 討論

3.1 中藥復(fù)方主要成分

中藥復(fù)方中成分的鑒定分析是中藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分之一，對(duì)闡明中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、開(kāi)發(fā)現(xiàn)代中藥新藥等具有重要意義[3]。藥用植物復(fù)方作用機(jī)理研究上和化學(xué)藥劑存在著顯著的區(qū)別。化學(xué)藥劑一般可明確其有效成分至單一化合物，但藥用植物活性物質(zhì)水煎液中化學(xué)成分大多以絡(luò)合態(tài)存在，種類較多，難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定性定量分析，其有效成分單一化合物無(wú)法解釋其總液表現(xiàn)出的功效，得到的一般為陰性結(jié)果。藥用活性物質(zhì)化學(xué)物質(zhì)之間可能存在協(xié)同效應(yīng)，不同活性部分對(duì)應(yīng)一個(gè)或多種功能，傳統(tǒng)化學(xué)藥劑分析方法顯然難以適應(yīng)藥用植物的生理生化特性，滿足藥用植物活性鑒定的需要。

在以往的研究中[18]，在藥用活性植物復(fù)配劑活性鑒定（即有效部位鑒定）中采用缺一味的方法（采用正交旋轉(zhuǎn)法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案）進(jìn)行活性檢測(cè)，由于其工作量大，可操作性低。后期筆者對(duì)復(fù)配劑總液進(jìn)行主要化學(xué)成分檢驗(yàn)。同時(shí)將總液用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、水層提取方法進(jìn)行提取形成水煎液后，分析不同極性部位水煎液中主要化學(xué)成分，為最終鑒定有效極性部位提供必要的化學(xué)分析基礎(chǔ)[19-20]。筆者可在本文研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將優(yōu)選出的復(fù)配物分4個(gè)部位提取浸膏，觀察各部位對(duì)病害防治靶標(biāo)的活性，進(jìn)一步系統(tǒng)研究其可能的防控機(jī)制。

3.2 中藥復(fù)方復(fù)配物防控太子參病害可能的機(jī)制

貴州太子參連作障礙現(xiàn)象較為嚴(yán)重，所以田間病毒病也較為普遍[21-23]。有研究報(bào)道，在太子參病毒病發(fā)病初期可用化學(xué)藥劑控制[14-15]，說(shuō)明化學(xué)藥劑的防效有限[24]。筆者先前采用中藥復(fù)方抗病毒劑對(duì)太子參病毒病進(jìn)行防治取得了較好的效果[12]。本文采用抑菌劑對(duì)真菌、細(xì)菌和病毒等病害進(jìn)行防治，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌和細(xì)菌病害發(fā)生率極低，但抑菌劑對(duì)病毒病的防治也具有較好的效果，盡管與中藥復(fù)方抗病毒劑相比效果略低。這可能與該抑菌劑中測(cè)得的總黃酮、生物堿、總木質(zhì)素、總有機(jī)酸含量較高有關(guān)[25-28]。病毒必須依賴宿主才能生存，阻斷病毒在宿主體內(nèi)任一復(fù)制環(huán)節(jié)均能達(dá)到抗病毒的目的[29]。中藥黃酮以及有機(jī)酸具有直接殺滅病毒、抑制病毒顆粒侵入細(xì)胞、抑制病毒核酸在宿主細(xì)胞的復(fù)制和合成、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)等作用[30]。雖目前未有關(guān)于植物病毒方面的防治報(bào)道，但能夠抵抗動(dòng)物體內(nèi)流感、乙肝、柯薩奇等病毒，并且效果顯著[31-33]。而生物堿以及木質(zhì)素在植物類病毒防治方面取得較為理想的效果[34]。如蹇軍友等[26]通過(guò)活性追蹤烏頭生物總堿對(duì)煙草花葉病毒的抗性，大量篩選后發(fā)現(xiàn)其對(duì)煙草花葉病毒侵染抑制率為23.5%。楊輝等[26]對(duì)不同抗性的辣椒品系接種黃瓜花葉病毒后，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的相對(duì)含量整體上呈上升趨勢(shì)，且表明其活性與抗病性呈顯著正相關(guān)。這些報(bào)道均與本研究結(jié)果較為一致，太子參中已報(bào)道的主要病毒病類型為煙草花葉病毒以及黃瓜花葉病毒[10-11,35]，而抑菌劑中高含量的總木質(zhì)素和總生物堿對(duì)其有較好的防治效果。具體是總生物堿亦或是總木質(zhì)素中何種成分對(duì)太子參病毒病具有抑制作用，還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果。

本研究采用抑菌劑單用，以及抑菌劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用的措施，在防治太子參病害的田間試驗(yàn)中取得了較好的防治效果，但由于試驗(yàn)的地塊有差異，所以2個(gè)地塊的防治效果不能完全在同一條件下進(jìn)行比較，但可以確定的是，無(wú)論是抑菌劑單用，或抑菌劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用均有推廣的可行性。

3.3 中藥復(fù)方最優(yōu)抑菌劑及抗病毒劑聯(lián)用在其他作物上推廣運(yùn)用

2019年在貴州遵義市運(yùn)用中藥復(fù)方技術(shù)處理‘紅顏’草莓，表現(xiàn)最好的為配方一處理，在苗期和大棚均施用或僅大棚施用，成活率和預(yù)防病害表現(xiàn)最佳。

本研究結(jié)果可用于抗性繁育，降低田間太子參病毒病發(fā)生率，實(shí)現(xiàn)病毒病可防可控，同時(shí)提高產(chǎn)質(zhì)量。本研究為太子參全生育期提供病毒病防控技術(shù)保障，同時(shí)也為中醫(yī)理論在植物領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

抑菌劑1號(hào)及3號(hào)對(duì)預(yù)防太子參真菌及細(xì)菌性病害，防控已經(jīng)發(fā)生的病毒病，提升產(chǎn)質(zhì)量具有顯著效果，其中抑菌劑1號(hào)效果最佳。有機(jī)級(jí)別復(fù)方病害防治制劑在病毒病治療、提高產(chǎn)量及提高太子參品質(zhì)上具有極為顯著作用。在綠色級(jí)別中，將復(fù)方1號(hào)抑菌劑及抗病毒劑與化學(xué)藥劑聯(lián)用，也能取得較好綜合表現(xiàn)，有助于形成有機(jī)及綠色級(jí)別太子參病害綜合防控技術(shù)體系。