張釜于，曾煉，羅昭，桑明，孫曉東，羅輝宇

(湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院1.麻醉科；2.中心實驗室；3.帕金森臨床研究中心；4.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，襄陽 441000)

羅哌卡因是臨床上應用廣泛的局部麻醉(局麻)藥[1-2]，但應用于椎管內(nèi)麻醉時可能引起短暫神經(jīng)綜合征和馬尾綜合征等神經(jīng)損傷癥狀[3-4]，甚至產(chǎn)生永久的運動及感覺異常，這與其對脊髓神經(jīng)元的毒性密切相關[5]。羅哌卡因引起神經(jīng)毒性的機制目前尚不清楚，其中神經(jīng)元凋亡增多是重要基礎[6]。研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因可以導致線粒體膜去極化，提高細胞內(nèi)pH值，引起細胞色素C的釋放，通過凋亡誘發(fā)神經(jīng)毒性[7]。除線粒體途徑外，還有報道羅哌卡因可誘導細胞中多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly (CADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]活化和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)耗竭，啟動caspase非依賴的凋亡，引起神經(jīng)毒性[8]。

Fas/FasL是死亡受體途徑中介導外源性細胞凋亡的重要分子。其中Fas又稱作APO-1/CD95，屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor ，TNF)受體家族重要成員，廣泛表達于多種組織和細胞中，多見于活化的淋巴細胞，其在細胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Fas與Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)結合可激活Fas相關死亡結構域(Fas associated death domain，F(xiàn)ADD)和procaspase-8，活化caspase-3[9]，最終導致細胞凋亡。Fas/FasL被證明在羅哌卡因處理的PC12細胞中表達上調(diào)[10]，并可在脊髓外傷中誘導神經(jīng)元凋亡[9，11]，但其在局麻藥引起的脊髓神經(jīng)元毒性中作用尚不明確。本實驗通過鞘內(nèi)注射不同濃度羅哌卡因，探究Fas/FasL是否與羅哌卡因誘導的大鼠脊髓背角細胞凋亡有關。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取清潔級健康雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號： SCXK(鄂)2016-008。置于適宜環(huán)境，溫度：(22±2)℃，相對濕度：50%～60%，每天光照12 h，自由進食水，適應性飼養(yǎng)1周。實驗由襄陽市第一人民醫(yī)院動物倫理委員會批準，倫理審查編號：2018DW003。

1.2主要試劑與儀器 鹽酸羅哌卡因(江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，純度>98%，批號：200115CA)；PE-10導管(Smith medical公司，批號：800/100/100)；Tunel染色試劑盒(Roche公司，批號：11684817910)；DAPI染液(批號：G1012)和兔抗大鼠 Fas、FasL多克隆抗體(批號：GB11089、GB11090-1)均購自Servicebio公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：C0105)；EVF3型電子測痛儀(Von Frey公司)；IX-71型倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)；RM2016型病理切片機(上海徠卡公司)。

1.3動物分組、模型制作及給藥 按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組及羅哌卡因小、中、大劑量組(0.5%，1%，2%)，每組5只。除空白對照組外，其余各組大鼠均進行鞘內(nèi)置管。大鼠鞘內(nèi)置管模型的制作：稱定質(zhì)量后，除空白對照組外，其余4組大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 g·kg-1麻醉。參照文獻[12]方法，將無菌的PE10導管沿硬脊膜破口置入蛛網(wǎng)膜下2 cm，導管內(nèi)可見腦脊液回流證明置管成功。充分沖洗導管后，逐層縫合，并將導管沿皮下固定至頸后。觀察大鼠術后恢復情況，排除術后出現(xiàn)下肢活動異常的大鼠。模型制作完成，在造模后第3天，使用微量注射器鞘內(nèi)注射1%利多卡因20 μL，并予以0.9%氯化鈉溶液10 μL沖洗導管，若大鼠在30 s內(nèi)出現(xiàn)雙側下肢麻痹、躲避反射和夾尾反射消失，同時雙上肢反射存在，并能2 h內(nèi)恢復，則證明利多卡因篩選實驗陽性，模型制作成功。參照文獻[13]，對造模成功大鼠鞘內(nèi)分別注射0.9%氯化鈉溶液和羅哌卡因(濃度分別為0.5%，1%和2%)，注射劑量均為0.12 mL·kg-1，注射時間12 h，每間隔1.5 h注射一次，共8次。空白對照組無處理。

1.4行為學觀察 采用電子測痛儀檢測大鼠機械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。操作如下：將待測大鼠置于底部打孔的有機玻璃箱中，底部為鐵絲網(wǎng)，使其適應環(huán)境15 min，使用電子測痛儀探針刺激大鼠后足掌部皮膚，逐漸加壓；當大鼠出現(xiàn)縮足反應時，儀器自動記錄引起縮足所需的刺激大小，即為大鼠MWT。每只大鼠進行3次檢測，每次檢測間隔15 min，分別在造模前1 d、給藥前(造模后3 d)和鞘內(nèi)給藥24 h后進行測量。

1.5組織取材與HE染色 給藥完畢后24 h，腹腔注射大鼠10%水合氯醛0.35 g·kg-1麻醉，處死后剪開脊柱，取脊髓腰膨大組織，加入4%多聚甲醛固定12 h，蠟塊包埋，組織切片，依據(jù)試劑盒說明書完成HE染色，光鏡下觀察脊髓組織結構的完整性，比較各組形態(tài)學改變。

1.6TUNEL染色 組織切片脫蠟至水，進行抗原修復和破膜。按試劑盒說明書取TUNEL試劑覆蓋組織，37 ℃水浴鍋孵育2 h，后用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)洗滌3次，每次5 min。去除PBS后，加DAPI染液避光，室溫孵育10 min復染細胞核，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，使用倒置熒光顯微鏡(200倍)觀察切片并采集圖像，每組選取脊髓背角3個隨機視野，統(tǒng)計TUNEL染色陽性細胞比例。

1.7免疫組織化學 各組包埋的蠟塊切片脫蠟至水。切片抗原修復后予以PBS洗滌3次，用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。切片在3% BSA室溫封閉30 min，分別加入Fas抗體(1：200)、FasL抗體(1：500)孵育；洗滌后加入一抗相應種屬辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1：200)，室溫孵育50 min。玻片置于PBS洗滌3次，加入DAB顯色液，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木精復染細胞核，裱片、熒光封片劑封片。每組選取4個隨機視野，顯微鏡下(400倍)觀察并采集圖像，使用ImageJ軟件計算視野下平均光密度。

2 結果

2.1MWT檢測值 與空白對照組比較，各模型組大鼠造模前后MWT均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型對照組和羅哌卡因小劑量組給藥24 h后，MWT與給藥前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，羅哌卡因中、大劑量組MWT較給藥前升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示高濃度羅哌卡因易引起感覺異常的神經(jīng)損傷癥狀。見表1。

表1 5組大鼠機械性縮足反射閾值

2.2對大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡的影響 低倍鏡(40×)下TUNEL熒光染色結果，顯示各組中大鼠脊髓組織輪廓清晰。高倍鏡(×200)下，空白對照組和模型對照組中僅存在少量凋亡細胞，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；羅哌卡因組均可在脊髓背角見到明顯增多的凋亡細胞，見圖1。與模型對照組比較，羅哌卡因組高倍視野下脊髓背角凋亡細胞比例增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與羅哌卡因小劑量組比較，羅哌卡因大劑量組凋亡細胞比例增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3脊髓組織形態(tài)改變 HE染色可見各組脊髓組織結構較為完整?？瞻讓φ战M和模型對照組脊髓背角中神經(jīng)元形態(tài)良好，核膜完整，細胞核深染致密，灰質(zhì)白質(zhì)清晰，神經(jīng)細胞排列均勻，未見明顯的炎性細胞浸潤。羅哌卡因小劑量組可見脊髓背角間質(zhì)輕度水腫，少量空泡形成；羅哌卡因中、大劑量組中脊髓背角間質(zhì)水腫明顯，大量空泡形成并可見部分神經(jīng)元核膜溶解，細胞核固縮、溶解、消失。見圖3。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。①與模型對照組比較，t=3.51～11.97，P<0.05；②與羅哌卡因小劑量組比較，t=4.36，P<0.05。

2.4脊髓組織中Fas、FasL表達的影響 Fas、FasL免疫組化陽性表達主要表現(xiàn)為神經(jīng)元胞質(zhì)著色，呈棕褐色的顆粒沉著?？瞻讓φ战M與模型對照組中大鼠脊髓灰質(zhì)背角細胞中僅有極低Fas和FasL表達，表達水平差異無統(tǒng)計學意義。與模型對照組比較，羅哌卡因組脊髓組織中Fas表達水平均升高(P<0.05)；與羅哌卡因小劑量組和羅哌卡因中劑量組比較，羅哌卡因大劑量組Fas表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。僅羅哌卡因大劑量組FasL表達明顯高于模型對照組(P<0.05)，見圖4，圖5。

3 討論

神經(jīng)損傷是局麻藥應用于臨床麻醉的并發(fā)癥之一[14]，傳統(tǒng)治療方法恢復過程緩慢，療效不理想，且無明確的預防措施。針對神經(jīng)損傷，局麻藥引起神經(jīng)毒性的機制一直是重要的研究方向。本實驗選取成年雄性SD大鼠制作鞘內(nèi)置管模型，通過鞘內(nèi)給予不同濃度羅哌卡因模擬臨床中長時間椎管內(nèi)麻醉，探究局麻藥引起神經(jīng)損傷的可能機制。結果顯示，與鞘內(nèi)給藥前比較，1% 和2% 濃度羅哌卡因處理24 h后，大鼠后足MWT明顯上升；與模型對照組比較，鞘內(nèi)注射羅哌卡因后，脊髓背角間質(zhì)明顯水腫、空泡增多，背角細胞的凋亡水平隨羅哌卡因濃度增加而增加，提示高濃度羅哌卡因更易誘導脊髓神經(jīng)元的凋亡并引起感覺異常等神經(jīng)損傷癥狀；同時羅哌卡因處理組中Fas、FasL表達水平較模型對照組明顯增加，呈劑量依賴。由此推斷：Fas/FasL可能參與羅哌卡因誘導大鼠脊髓背角細胞凋亡的過程。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。①與模型對照組比較，t=5.26～10.10，P<0.05；②與羅哌卡因小劑量組比較，t=3.17，P<0.05；③與羅哌卡因中劑量組比較，t=3.67，P<0.05。

針對調(diào)控Fas/FasL的表達，近期研究發(fā)現(xiàn)，通過siRNA干擾p38 MAPK可明顯抑制PC12細胞和U87細胞中Fas的表達水平[15]，提示p38 MAPK可能是調(diào)控Fas表達的上游分子，而其是否參與調(diào)節(jié)羅哌卡因誘導的脊髓組織中Fas表達上調(diào)值得進一步探究。本課題組下一步將通過siRNA和p38 MAPK抑制劑干擾Fas/FasL通路進一步驗證Fas/Fasl在羅哌卡因誘導神經(jīng)毒性中的具體作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在鞘內(nèi)注射羅哌卡因誘導大鼠神經(jīng)損傷和脊髓背角細胞凋亡的過程中Fas/FasL的表達增加，提示Fas/FasL可能參與了羅哌卡因誘導的神經(jīng)毒性，這為臨床預防和治療羅哌卡因引起的脊髓神經(jīng)損傷提供理論基礎和實驗依據(jù)。